不同酒齡傳統紹興黃酒的特征風味物質分析

趙培城，蔡際豪，顧賽麒，錢 斌，王 蘭，呂 飛,，丁玉庭,

（1.浙江工業大學食品科學與工程學院，浙江 杭州 310000；2.紹興國家黃酒工程技術研究中心有限公司，浙江 紹興 312000）

陳釀是黃酒生產工藝中重要的過程之一，黃酒的陳釀時間也稱為酒齡，是評價黃酒優劣的重要指標[1-2]。傳統紹興黃酒在陳釀的過程中發生大量的化學和物理變化，這些變化對于酒體的穩定性和協調性起關鍵的作用[3]。早期對黃酒陳釀風味的研究多集中于黃酒陳釀過程中還原糖、乙醇體積分數、游離氨基酸、總酸等基本理化指標的變化分析[4-6]。Xiang Wenliang等[7]對嘉興喂飯酒貯存過程中理化指標總酸、還原糖、揮發酯、非糖固形物、游離氨基酸等變化進行分析，并對風味轉化機理進行初探。隨后氣相色譜、氣相色譜-質譜等技術及各種樣品前處理方式開始廣泛應用于黃酒揮發性組分的研究。江偉等[8]采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜對不同陳釀時間的黃酒進行揮發性化合物包括醇、酸、酯、醛、酚類共34 個物質進行全定量分析，并且對這些物質在陳釀過程中的變化規律進行研究。隨著基于傳感器的人工味覺和人工嗅覺在食品行業的應用，江濤等[9]使用Flash氣相色譜型電子鼻對黃酒進行酒齡定量研究，建立了偏最小二乘回歸模型判定酒樣酒齡，可信度高。

當前，將風味物質的化學分析與感官評價相結合，尤其是滋味物質與黃酒感官特性的相關性研究鮮見報道。因此本實驗采用固相微萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術檢測黃酒陳釀過程中揮發性風味物質，采用高效液相色譜法測定有機酸和游離氨基酸含量，同時對不同陳釀年份紹興黃酒的氣味和滋味進行感官描述性分析，結合SPSS應用主成分分析確定不同酒齡黃酒的特征香氣物質和滋味物質。本實驗為高質量的傳統紹興黃酒的釀造提供理論基礎，保證傳統紹興黃酒的風味保真性與穩定性，對傳統紹興黃酒提升市場競爭力提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

傳統紹興黃酒（1、3、5、8 a與10 a陳），取自代表性紹興黃酒廠家的不同陳釀酒缸中。每個年份各取3 批次，重復3 次，樣本存放于－4 ℃冰箱中，于15 d內用完。

2-辛醇（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；氯化鈉、磷酸氫二鉀、異硫氰酸苯酯乙腈、三乙胺乙腈、酒石酸、蘋果酸、丙酮酸、乳酸、醋酸、檸檬酸、琥珀酸、半胱氨酸、天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

E2695型高效液相色譜儀 美國Waters公司；HYJD超純水器 杭州永潔達凈化科技有限公司；FA2004型電子分析天平 常州市衡正電子儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發性風味物質測定

1.3.1.1 樣品預處理

取10 mL各酒齡的傳統紹興黃酒，25 ℃、3 000 r/min離心20 min，處理好的黃酒樣品待用[10-12]。

1.3.1.2 頂空固相微萃取

取5 mL完成離心的黃酒樣品，放入20 mL頂空瓶，加入5 μL內標物（2-辛醇，質量濃度為89.65 μg/L），2.5 g氯化鈉，萃取溫度50 ℃，預熱15 min，萃取時間40 min，解吸5 min（250 ℃），采用50/30 μm DVB/CAR/PDMV萃取頭[13-15]。

1.3.1.3 氣相色譜-質譜測定

色譜條件：DB-Wax毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；程序升溫：柱初始溫度40 ℃保持5 min，以5 ℃/min上升至150 ℃，再以10 ℃/min上升至230 ℃，然后保持10 min。載氣為高純度氦氣，流速1.0 mL/min，進樣口溫度250 ℃，進樣方式為不分流進樣[16-18]。

質譜條件：電子電離源；接口溫度230 ℃；電子能量70 eV；離子源溫度210 ℃；質量掃描范圍30～550 u。

1.3.2 有機酸含量測定

1.3.2.1 樣品預處理

取5 mL離心酒樣至25 mL容量瓶中，用流動相定容到刻度，酒樣需經0.22 μm混合纖維樹酯膜抽真空過濾，直接進樣[19]。

1.3.2.2 流動相配制

稱取磷酸氫二鉀10.88 g置于1 000 mL容量瓶中，用超純水定容，濃度為0.08 mol/L。通過磷酸調節pH值至2.80，在經0.22 μm混合纖維樹酯膜抽真空過濾后使用[20]。

1.3.2.3 有機酸標準樣配制

分別準確稱取8 種有機酸置于50 mL燒杯中，用流動相溶解并定容配制成有機酸標樣系列溶液及有機酸混合標準液，見表1。

表1 有機酸標準樣品混合液Table 1 Concentration of mixed solution of organic acids

1.3.2.4 高效液相色譜條件

Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.08 mol/L磷酸二氫鉀溶液（用磷酸調節pH值為2.80）；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL；檢測波長215 nm；柱溫30 ℃[21-22]。

1.3.3 游離氨基酸含量測定

1.3.3.1 樣品預處理

取對照品混合溶液（半胱氨酸為1.25 mmol/L，其他16 種游離氨基酸濃度為2.5 mmol/L）或黃酒基酒樣品50 μL，置于2 mL離心管中，加150 μL高純水，再加入0.1 mol/L異硫氰酸苯酯-乙腈溶液100 μL、1 mol/L三乙胺-乙腈溶液100 μL，混勻。室溫放置1 h后，加入400 μL正己烷，旋渦混合器振蕩1 min，靜置10 min。下層溶液經0.22 μm濾膜過濾后進樣，進行色譜分析[23-24]。

1.3.3.2 高效液相色譜條件

Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫38 ℃；二極管陣列檢測器：檢測波長254 nm；進樣量10 μL；1 mL/min流速梯度洗脫；流動相及其梯度洗脫程序見表2[25]。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Mobile phase gradient program

1.3.4 感官描述

進行氣味和滋味的感官描述性分析。氣味包括醇香、醬香、曲香、酯香、米香、焦香、異香、協調和留香。滋味指標包括甜、酸、苦、鮮、辣、麻、澀、醇厚、綿延度和酒體。分值為0～5 分，5 分為對應特征最強，例如，氣味的協調性，5 分非常協調，4 分較協調，3 分一般協調，2 分較不協調，1 分不協調，0 分極不協調[26]。

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0軟件對實驗數據進行主成分分析。氣味特征分析將香氣活力值大于1的揮發性風味物質與氣味描述性感官評分進行主成分分析，再與不同年份紹興黃酒氣味成分得分散點圖進行擬合，評價不同酒齡傳統紹興黃酒的優勢氣味特征。滋味特征分析將滋味活力值大于1的有機酸和游離氨基酸與滋味感官評分進行主成分分析，再與不同年份紹興黃酒滋味成分得分散點圖進行擬合，評價不同酒齡傳統紹興黃酒的優勢滋味特征[27-30]。

2 結果與分析

2.1 傳統紹興黃酒氣味特征分析

2.1.1 揮發性風味物質含量與香氣活力值

圖1 不同酒齡傳統紹興黃酒揮發性風味物質總量Fig. 1 Amount of various classes of volatile flavor substances in traditional Shaoxing rice wines of different ages

如表3所示，從不同年份傳統紹興黃酒中共檢測鑒定出50 種主要揮發性風味化合物，其中主要包括16 種醇類、20 種酯類、7 種醛類、4 種酸類，3 種其他物質。

如表3所示，傳統紹興黃酒揮發性物質主要為醇類、酯類、醛類、酸類。醇類物質含量最高，1、3、5、8、10 a陳紹興黃酒總醇類質量濃度分別為740.74、677.83、625.98、603.41、523.85 mg/L，其中β-苯乙醇和異戊醇在醇類中占比較大，1、3、5、8、10 a陳紹興黃酒苯乙醇和異戊醇質量濃度分別為75.42、81.46、85.63、98.64、107.26 mg/L和94.34、85.58、73.84、64.18、52.44 mg/L，分別占醇類總量的10.1%～20.4%和12.7%～10.01%。傳統紹興黃酒檢出20 種酯類物質，其含量也相對較高，其中1、3、5、8 a陳和10 a陳傳統紹興黃酒乳酸乙酯、丁酸乙酯和乙酸乙酯的質量濃度分別為18.34、28.62、48.63、68.12、84.56 mg/L，38.35、42.28、44.36、41.22、48.12 mg/L和8.68、14.26、18.98、21.86、24.76 mg/L。1、3、5、8 a陳和10 a陳傳統紹興黃酒揮發性醛類物質物質總量分別為283.42、244.65、215.52、179.81、154.28 mg/L，比醇類物質含量低。相對含量較高的是苯甲醛、苯乙醛和糠醛。揮發性酸類物質的質量濃度較低，為39.42～68.81 mg/L，黃酒揮發性酸類物質中主要為乙酸和戊酸，質量濃度為10.24～25.83 mg/L和14.87～55.63 mg/L。表3中香氣活力值大于1的揮發性風味物質主要有乙酸乙酯、己醇、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲醛、5-甲基糠醛、辛醇、戊酸、苯乙醛、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、γ-壬內酯和辛酸等。如圖1所示，方差分析差異顯著。揮發性醇類物質含量逐年下降，而揮發性酯類含量物質逐年增加，這和隨著陳釀時間延長，部分揮發性醇類物質酯化形成揮發性酯類物質有關。同時揮發性醛類物質含量也是逐年下降，揮發性酸類物質變化較小。

2.1.2 氣味描述性分析

圖2 不同酒齡傳統紹興黃酒基酒氣味感官評分Fig. 2 Sensory scores for smell of traditional Shaoxing rice wines of different ages

如圖2所示，1 a陳和3 a陳傳統紹興黃酒醇香、醬香和曲香得分較高，高年份傳統紹興黃酒則在酯香、協調和留香得分較高，其他方面得分相差不大。

2.1.3 傳統紹興黃酒特征揮發性風味物質分析

圖3 揮發性風味物質和氣味描述分析主成分載荷圖Fig. 3 PCA loading plot of volatile flavor and odor description

以15 個樣本的香氣物質的香氣活力值、氣味描述分析結果利用SPSS進行主成分分析，并與傳統紹興黃酒的年份聯立。經過有限次剔除后，保留的成分有乙酸乙酯、己醇、異戊醇、己酸乙酯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、苯甲醛、5-甲基糠醛、辛醇、戊酸、苯乙醛、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、苯乙醇、γ-壬內酯和辛酸。提取的第1、2主成分的方差貢獻率累計達到了87.56%，第1主成分構成的信息量占總信息量的77.59%，第2主成分占9.97%。

表4 不同酒齡傳統紹興黃酒有機酸含量與滋味活力值Table 4 Organic acid contents and taste activity values of traditional Shaoxing rice wines of different ages

表5 不同酒齡傳統紹興黃酒游離氨基酸含量與滋味活力值Table 5 Free amino acid contents and taste activity values of traditional Shaoxing rice wines of different ages

如圖3所示，與第1主成分相關系數較大的化合物為乙酸苯乙酯、苯甲醛、乙酰基苯、糠醇、苯乙醛、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、戊酸、異戊醇、辛酸乙酯、乳酸乙酯和5-甲基糠醛。其中，乙酸苯乙酯、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯、乳酸乙酯對樣品的香氣呈正相關且系數很大。結合圖3可以看出，10 a陳的黃酒受乙酸苯乙酯、糠醇、苯乙酸乙酯和乙酸乙酯的影響較大，8 a陳的黃酒受乙酰基苯、乳酸乙酯、辛酸乙酯、γ-壬內酯和己酸乙酯香氣成分的影響較大。5 a陳黃酒樣品與之對應的香氣物質是辛酸。異戊醇和苯甲醛與3 a陳黃酒樣品香氣有關。苯乙醇、5-甲基糠醛、辛醇、苯乙醛和戊酸對1 a陳的黃酒樣品有顯著影響。由此看出，高低年份的傳統紹興黃酒在香氣物質上有顯著區別。結合感官描述性分析，5 個年份的傳統紹興黃酒基本區分開。其中低年份黃酒更為醇香、曲香，與苯乙醇、異戊醇和苯甲醛為主要特征風味物質有關，高年份黃酒更為酯香、留香和協調，與乙酸苯乙酯、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯和乳酸乙酯為主要特征風味物質有關。

2.2 滋味特征分析

2.2.1 有機酸與游離氨基酸含量與滋味活力值

從不同年份傳統紹興黃酒中共定量檢測出7 種有機酸：醋酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、琥珀酸和丙酮酸。16 種游離氨基酸：天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸和精氨酸。

如表4、5所示，傳統紹興黃酒中有機酸含量最高的為醋酸和乳酸，1、3、5、8、10 a陳傳統紹興黃酒中醋酸和乳酸質量濃度分別為627.84、662.0、715.9、725.5、713.2 mg/L和356.2、382.9、401.8、407.4、427.5 mg/L，含量隨著陳釀時間延長逐漸增加，除了丙酮酸以外其他種類的有機酸含量則逐年減少。游離氨基酸中蛋氨酸與組氨酸的質量濃度較低，分別為7.4～19.0 mg/L和65.6～113.0 mg/L，其他種類游離氨基酸含量差別不大，質量濃度最多的為丙氨酸，為374.2～444.4 mg/L。1 a陳和10 a陳紹興黃酒中游離氨基酸變化幅度最大的為蛋氨酸，10 a陳紹興黃酒蛋氨酸含量比1 a陳減少了約60%。滋味活力值較大的有機酸和游離氨基酸分別為乳酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、組氨酸、酒石酸、天冬氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸和精氨酸。

2.2.2 滋味描述性分析

圖4 不同酒齡傳統紹興黃酒滋味感官評分Fig. 4 Sensory scores for taste of traditional Shaoxing rice wines of different ages

如圖4所示，1 a陳和3 a陳傳統紹興黃酒酸、鮮和辣的得分較高，高年份傳統紹興黃酒則在醇厚和綿延度的得分較高，而在其他方面分數相差不大。

2.2.3 傳統紹興黃酒特征滋味物質分析

圖5 有機酸、游離氨基酸和滋味感官評分主成分載荷圖Fig. 5 PCA loading plot of organic acids, free amino acids and sensory scores for taste

以15 個樣本滋味活力值大于1的滋味物質和滋味感官評分利用SPSS進行主成分分析，經過有限次剔除后，保留的成分有乳酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、蘇氨酸、天冬氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和酒石酸。如圖5所示，提取的第1、2主成分的方差貢獻率累計達到了91.32%，第1主成分構成的信息量占總信息量的79.25%，第2主成分占12.07%。

如圖5所示，與第1主成分相關系數較大的化合物分別為乳酸、檸檬酸、天冬氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和甘氨酸。其中乳酸、檸檬酸、蛋氨酸、天冬氨酸和甘氨酸對樣品的滋味呈正相關且系數較大。可以看出10 a陳的黃酒受檸檬酸、乳酸和蛋氨酸影響較大，8 a陳的黃酒受酒石酸、丙氨酸和天冬氨酸影響較大，5 a陳的黃酒受酪氨酸、蘋果酸和精氨酸影響較大，3 a陳的黃酒受蘇氨酸影響，苯丙氨酸、琥珀酸和異亮氨酸對1 a陳的黃酒滋味貢獻度最大。結合感官評分分析，其中低年份黃酒更為甜、酸和辣，與琥珀酸和異亮氨酸為主要特征滋味物質有關，高年份黃酒更為醇厚、綿延與檸檬酸、乳酸和蛋氨酸為主要特征滋味物質有關。

3 結 論

不同年份傳統紹興黃酒揮發性風味組分共檢測鑒定出50 種，其中主要包括16 種醇類、20 種酯類、7 種醛類、4 種揮發性酸類，3 種其他物質。利用香氣活力值進行主成分分析不同年份傳統紹興黃酒的特征揮發性風味物質，其中10 a陳的黃酒受乙酸苯乙酯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯和辛酸乙酯的影響較大，8 a陳的黃酒受乙酰基苯、乳酸乙酯、γ-壬內酯和己酸乙酯香氣成分的影響較大。5 a陳黃酒樣品與之對應的香氣物質為辛酸。異戊醇和苯甲醛與3 a陳黃酒樣品香氣有關。苯乙醇、5-甲基糠醛、辛醇、苯乙醛和戊酸對1 a陳的黃酒樣品有顯著影響。由此看出，高低年份的傳統紹興黃酒在香氣物質上有顯著區別。結合氣味描述性分析，5 個年份的傳統紹興黃酒基本區分開。其中低年份黃酒更為醇香、曲香，與苯乙醇、異戊醇和苯甲醛為主要特征風味物質有關，高年份黃酒更為酯香、留香和協調，與乙酸苯乙酯、乙酰基苯、糠醇、苯乙酸乙酯、乙酸乙酯、辛酸乙酯和乳酸乙酯為主要特征風味物質有關。測定7 種有機酸與17 種游離氨基酸，結合滋味活力值進行主成分分析，10 a陳的黃酒受檸檬酸、乳酸和蛋氨酸影響較大，8 a陳的黃酒受酒石酸、丙氨酸和天冬氨酸影響較大，5 a陳的黃酒受酪氨酸、蘋果酸和精氨酸影響較大，3 a陳的黃酒受蘇氨酸影響，苯丙氨酸、琥珀酸和異亮氨酸對1 a陳的黃酒滋味貢獻度最大。結合滋味描述性分析，其中低年份黃酒更為甜、酸和辣，與琥珀酸和異亮氨酸為主要特征滋味物質有關，高年份黃酒更為醇厚、綿延，與檸檬酸、乳酸和蛋氨酸為主要特征滋味物質有關。傳統紹興黃酒風味差異的原因主要是陳釀過程中乙醇和其他少量的高級醇在貯存過程中與有機酸發生酯化反應，生成相關酯，各種酯又有其特殊的香味，同時陳釀過程中會有少量醇揮發，加上乙醇氧化、乙醛縮合以及乙醇與水的締合作用，一系列復雜的氧化與還原作用，使風味物質之間產生差異。