匡翠方：讓國產高端光學顯微鏡走向世界

王 涵

匡翠方（右1）及項目主要成員

2018年，世界衛生組織公布數據顯示，全球有1810萬癌癥患者，其中960萬人死于癌癥。而在我國，幾乎平均每分鐘就有7.5人被確診為癌癥患者，每分鐘有4.5人被癌癥奪去寶貴的生命。在2020年的2月4日，世界癌癥日之際，世衛組織更是發出警告，如按目前趨勢繼續下去，未來20年，全球癌癥病例將增加60%。

這一連串的數字，讓人震驚之余更感心痛。為什么會有這樣的情況發生？癌癥的機理是什么？如何準確地去診療癌癥？在回答這些問題前，人類首先要明白癌癥細胞的生長演變過程，清楚癌癥細胞中蛋白質等微細的結構。但細胞生命活動的眾多反應都發生在各細胞器中（如基因的轉錄、蛋白的合成與運輸、物質的交換等），其尺度均在納米量級。因此，納米尺度超高分辨率顯微鏡成為細胞觀測的重要工具。它的研發將有力地促進疾病的診斷、療效的監測、新藥物的開發等。

在各種類型的顯微鏡中，電子顯微鏡和原子顯微鏡雖擁有超高分辨率，但它們都有一個最大的缺點——難以進行活體細胞的觀測。傳統的光學顯微鏡雖然可以克服這個缺點，但在應用方面存在著諸多限制，例如樣品普適性差、分辨率偏低、信息維度單一等。這些難以逾越的障礙就像魔咒一樣束縛了科學家的思維。為了破解魔咒，他們不斷地努力著，浙江大學光電科學與工程學院教授匡翠方正是其中之一。

推動高端光學顯微鏡產業化發展

白駒過隙，彈指一揮間，2020年已是匡翠方來到浙江大學的第11個年頭了。翻看他的履歷，似乎與“浙江”并沒有多大關聯：2007年，獲得北京交通大學物理系博士學位；2008年，在北京理工大學光電系完成博士后研究工作；同年，遠赴美國南卡羅萊納大學（University of South Carolina）進一步深造，2010年完成該校機械工程系博士后研究工作。當被問到為何在回國后直接選擇了浙江大學時，匡翠方解釋道：“在國內各高校和科研院所中，浙江大學在光學工程研究方面一直都處于領先水平，有優秀的實驗研究環境，非常關注超分辨率成像的研究，并對超分辨率成像團隊提供了極大的支持。當時浙大的劉旭老師已經開始著手相關研究，急需相關人才，便向學院領導推薦了我。再加上我的妻子也在浙江工作。不論對于工作還是家庭，來浙江大學都是一個很好的選擇。”

匡翠方主要從事的是超分辨成像方面的研究。在這11年里，他先后參與和主持了浙江大學“紫金計劃”項目、現代光學儀器國家重點實驗室自立項項目“基于微納結構受激發射損耗超分辨率熒光顯微方法”，教育部博士點基金“基于點擴散函數工程的超分辨熒光顯微方法的研究”，國家原“973”基礎研究子課題、國家自然基金重點項目子課題、科技部重大儀器專項課題等多個項目，以第一發明人授權發明專利50多項，以第一作者或通訊作者發表論文120多篇，并獲得浙江省“新世紀151人才工程”第二層次培養人員、中國光學學會首屆中國光學科技獎應用成果類一等獎、國家技術發明獎二等獎等多項榮譽。

面對這些豐碩的成果，匡翠方在欣喜之余也表達了深深的擔憂：“我們的光學超分辨顯微成像研究技術與國外的差距在逐漸縮小，但在實際產業化方面仍然比較落后。雖然我國每年顯微鏡產量超過300萬，其中超過一半用于出口，在全球顯微鏡市場中占有一席之地，但這些產品主要集中在中低端，在利潤方面遠不及高端顯微鏡產品。由于受行業技術水平限制，國內具備生產高端顯微鏡的企業屈指可數，因此我國高端顯微鏡差不多90%都依賴于進口。”

事實上，高端光學顯微鏡的市場前景非常廣闊。Grand View Research發布全球顯微鏡市場研究報告顯示，到2020年全球顯微鏡市場容量預計將達到95.4億美元。隨著科技發展和人們生活水平的提高，高端光學顯微鏡會更廣泛地應用于實驗室和醫療檢測等方面。而世界高端顯微鏡的產業主要布局在德國和日本。德國以蔡司（Zeiss）和徠卡（Leica）公司為代表，日本以尼康（Nikon）和奧林巴斯（Olympus）公司為代表，業內稱之為“四大家”。這四家都是所在國家的支柱企業，也是百年老店，它們占據著世界顯微鏡市場50%以上的市場份額，其發展戰略左右著顯微鏡市場的走向。

“目前中國所有三甲醫院所使用的高端光學顯微鏡幾乎都來自四大家，近年來共聚焦掃描和超分辨顯微鏡在中國市場的增長更是超過20%，對中國企業而言，如果能夠制造出高性能、高可靠性的高端光學顯微鏡，無疑會迎來極大的市場機遇，并完成升級，進入世界精密儀器制造第一方陣，推動我國精密光學元器件制造、光學材料、精密加工等行業的發展。”匡翠方表示，在國內，有能力且開始生產高端顯微鏡的廠家主要是永新光學、舜宇股份、麥克奧迪等企業。近年來，這些企業都在加大研發力度，加速追趕步伐。

為了更好地實現高端光學顯微鏡的產業化發展，匡翠方與永新光學合作開展了單分子熒光探測、熒光漂白及光切片成像技術方面的研究。匡翠方以單分子熒光探測為例，向記者解釋道：“傳統的分子和細胞生物學技術已經比較深入地闡明了生物分子的構成及其所扮演的角色，但是單個分子的活動卻被平均化而觀察不到。全內反射熒光顯微技術利用全內反射產生的倏逝波對樣品表面薄層進行觀察，而不受細胞深層區域信號的干擾，具有其他熒光成像技術無法比擬的高信噪比。對生物樣本損傷小，可實現對單個熒光分子的直接探測。尤其對需要研究細胞表面科學如生物化學動力學、單分子動力學等方向的研究十分有效。”

基于該課題，項目所開發的高性能熒光顯微成像技術采用了結合多角度環全內反射熒光顯微技術（Ring-TIRF）、光切片熒光顯微系統（Light-sheet）技術以及定點照明技術（FRAP）為一體的高分辨顯微成像儀。利用全反射顯微技術，通過倏逝波照明，根據倏逝波光強在全反射面處呈指數形式衰減的特性，熒光樣品只會在全反射面附近被激發，實現了樣品貼壁層縱向200nm分辨率的照明成像；利用光切片成像橫向照明技術，照明光被聚焦成一個薄層照亮樣品，進一步提高顯微系統的軸向分辨率，同時利用其層掃描技術可以實現Z軸掃描，實現層析成像；利用FRAP定點照明技術，利用掃描振鏡與反饋矯正技術實現系統的精準定位，通過軟件控制進行位置選取與照明。

由此項目開發出的高分辨熒光顯微成像儀將光機電算一體化，可以實現光切片成像、動態成像、熒光標記與共定位、三維空間還原、定量或半定量分析、單分子熒光探測、熒光漂白后恢復（FRAP)等技術，為生命科學領域研究提供幫助；而由此產生的共性化技術將帶動環境、資源、農業、醫療、衛生、健康、食品、農產品、水產品等一大批應用領域的專用儀器的開發，推動國產激光器、光譜儀、探測器等器件與技術的進步。

團隊照片

逐一擊破光學超分辨技術難點

“工欲善其事，必先利其器”。在國家加快培育戰略性新興產業、壯大經濟發展新動能的當下，光學顯微鏡對于新材料、生物等新興產業的發展具有影響創新能力的基礎性地位。然而對于大部分光學顯微鏡用戶而言，現有的光學超分辨技術缺乏全面反映樣品生命活動的能力，在解決目前生命科學領域重大問題方面所做出的貢獻依然甚微。作為研究或檢測平臺的超高分辨率顯微系統的研制和發展，將極大促進生物、醫學、材料等領域的原始創新，利于我國相關學科占領相應科學研究的制高點。

“在生物學研究中，科學家們常常利用能發射熒光的熒光分子作為生物標記。將這種熒光分子通過化學方法掛在其他不可見的分子上，原來不可見的部分就變得可見了。生物學家一直利用這種標記方法，把原本透明的細胞或細胞器從黑暗的顯微鏡視場中‘揪出來’。例如綠色熒光蛋白在藍色波長范圍的光線激發下，會發出綠色熒光，可以標識生物體內蛋白質的位置。在進行生物醫學研究時，除了觀測細胞微觀結構的空間特性外，時間特性也是記錄和分析細胞生命活動、蛋白質功能分析和藥物療效評估等的重要手段。對于具有熒光標識的樣品而言，反映樣品時間特性的參量是熒光壽命。”匡翠方說，熒光壽命可以反映細胞生命活動的環境參量，例如環境P H值、離子濃度、含氧量等，同時也是區分熒光蛋白分子、反映熒光蛋白分子動力學特征的重要參數，在細胞生物學等領域中具有廣泛應用。

為此，匡翠方帶領團隊開展了“基于非線性焦斑調制及k空間虛擬波矢解調的超分辨顯微成像系統”項目的研究，該項目旨在前期研究的基礎上，成熟運用空間相位調制技術、非線性飽和焦斑激發技術和并行時空探測技術，研究基于非線性焦斑調制及k空間虛擬波矢解調的三維超高分辨顯微成像技術和系統，使系統對熒光樣品沒有特殊要求，分辨率約提高至λ/12，且熒光壽命成像速度至少上升一個數量級，并最終研制出具有自主知識產權、對樣品高度普適、高速調制與探測時空信息的多色超分辨顯微儀器。匡翠方和他的團隊成員希望通過該項目的研究，實現課題組自己研制的儀器在生物醫學研究中得到驗證與廣泛應用。這不僅可以進一步促進光學超分辨顯微技術的發展和完善，而且可以提升我國在該領域儀器及技術的話語權。目前項目正在井然有序的開展當中，圍繞研制具有自主知識產權的高端顯微成像儀器這一共同目標，課題組成員在不辭辛苦地日夜奮戰。

匡翠方還積極參與到劉旭教授的課題項目“并行納米光場調控熒光輻射微分三維超分辨成像系統”的研究中。該項目以囊泡運輸過程的監控研究為側重點，從而開發出一種具有長時程、實時、三維納米尺度分辨本領的活體細胞顯微成像方法與儀器。

“千磨萬擊還堅勁，任爾東西南北風。”不斷進行光學超分辨技術的科研探索，研發出國產高端光學顯微儀器，一直是匡翠方作為科研工作者的初衷。縱然這條道路注定荊棘密布，他也定將永不止步。“我有一個心愿，那就是讓我們的高端光學顯微鏡走向世界。”匡翠方說。