采煤塌陷地抗生素抗性基因污染現狀與機理分析

袁 濤，程 森，路 平，瞿 旭

(1.江蘇建筑職業技術學院，江蘇 徐州221116；(2.中國礦業大學 環境與測繪學院，江蘇 徐州221116)

0 引言

抗生素是微生物在生活過程中產生的能夠抗病原體的物質，還被用作飼料添加劑和獸藥。目前它們被越來越多地用于畜禽養殖，以治療感染和促進生長，其生產量、使用量均得到了快速增長。我國是抗生素生產和使用大國，抗生素濫用現象十分嚴重，使用的抗生素包括紅霉素、慶大霉素、諾氟沙星和阿莫西林等，不能完全被動物吸收，大部分會伴隨動物的糞便和尿液釋放到環境中。如果這些糞便沒有得到正確的處理，抗生素殘留物便會直接釋放進入土壤，通過淋溶、滲濾等方式遷移到其他環境介質，造成環境中抗生素的廣泛存在，并誘導細菌產生耐藥性。

根據2017年聯合國環境署發布的《2017前沿報告》和2019年中國工程院戰略咨詢中心發布的《全球工程前沿》報告，抗生素抗性基因(ARG)是一種新興環境污染物，ARG的遷移是生態環境領域科學研究前沿。雖然ARG普遍存在于環境[1]，來自家庭、醫院、制藥系統和農業徑流等方面的抗菌化合物被釋放到環境中后，將會與自然細菌群落發生直接接觸，從而演變出更多的耐藥細菌。抗生素和生化因素選擇壓力下，加劇了細菌耐藥性，例如超級細菌金黃色葡萄球菌(MRSA)和肺炎克雷伯菌等菌。根據英國媒體發布的奧尼爾勛爵(Lord O’Neill)報告，到2050年，每年因ARG而死亡的人數可達1 000萬人，甚至高于當今癌癥造成的死亡。我國對ARG的傳播問題越來越重視。中國政府相繼出臺了《遏制細菌耐藥國家行動計劃(2016-2020年)》，《中國兒童合理使用抗菌藥物行動計劃(2017-2020)》、《2017年動物源細菌耐藥性監測計劃》，旨在從國家、社會各層面出發，多領域入手，遏制細菌耐藥，保護生態環境，維護人民群眾的身體健康。

采煤塌陷區較多采取漁業、農業復墾。水產/畜禽養殖、糞肥/污水灌溉、生活污水排放等產生大量抗生素，在大氣降水沖刷下，匯集于采煤塌陷低洼積水區底質。底質成為環境中抗生素及抗生素抗性基因(ARG)的重要儲存庫[2]，污染地表水和地下水，危害城鄉供水安全[3]。更可怕的是，底質中細菌長期暴露于抗生素的選擇壓力之下，加劇抗生素抗性基因(ARG)廣泛傳播和擴散，可能嚴重降低抗生素療效，對公眾健康、生態系統健康構成威脅，并且，阻礙礦區土地復墾和生態修復進程，成為可持續發展的制約性因素。通過對我國東部煤礦采煤塌陷地土壤與地下水調查，檢出5類抗生素(四環素類、大環內酯類、奎諾酮類、青霉素類、磺胺類和林可霉素類)，鐵、錳、鉻、鎘、砷等重金屬，硫酸鹽和氟化物等無機鹽，12種揮發性有機物，13種半揮發性有機物等污染物質。宏基因組測序顯示evgS、macB、sav1866、ethA、katG等多種ARG在采煤塌陷地淺層地下水被檢出，最高相對豐度達3.90×102PPM。地下水中抗生素耐藥細菌不動桿菌屬Acinetobacter相對豐度高達55.53%，Acinetobacter是感染人類的重要致病菌，可引起呼吸道感染、敗血癥、腦膜炎、心內膜炎、傷口及皮膚感染、泌尿生殖道感染等，重癥者可導致死亡。

國內外均有ARG污染地下水的報道[4]，尤其我國多個城市地下水[5]、鄉村井水[6]、畜禽養殖區井水[7]、垃圾填埋場地下水[8]，存在大量的ARG，豐度范圍在102-1011copies/L。歐洲地下水發現多種ARGs(tetO、ampC、ermB、vanA、mecA和blaSHV-5等)，絕對豐度在 104- 108copies/L之間。垃圾填埋場賦存大量ARG，調查發現周圍地下水共檢測到近200種ARG，絕對豐度在109- 1011copies/L數量級之間[8]。全國城市地下水也存在ARG污染現象，主要包括四環素類ARG、磺胺類ARG，絕對豐度約在103-1011copies/L之間不等[5]。鄉村的井水是當地重要的水源，井水中也分離到的廣譜抗菌藥耐藥基因[6]。總所周知，畜禽養殖是ARG重要排放源，但是其地下水環境中ARGs的分布情況鮮為報道。我國某畜禽場地下水四環素類、磺胺類等ARG豐度約為102-105copies/L數量級之間[7]。一些研究認為可能是土壤中ARG通過降雨入滲從地表運輸到地下水中，但是，ARG從地表遷移到地下水的路徑和遷移機理尚不明確。多數研究僅報道了ARG的總體豐度，沒有進一步區分ARG是存在于微生物細胞內的DNA(胞內ARG)，還是以游離態DNA存在于細胞外的無機環境(胞內ARG)。然而，胞內ARG和胞外ARG在生態環境中的遷移行為截然不同，污染地下水的機理不明，將從以下幾方面做簡要分析：

1 ARG的胞間轉移與分配影響地下水污染

ARG通常包含在質粒或整合子中，可通過水平基因轉移到細菌體內(胞內ARG)，或存在于無機環境中(胞外ARG)。ARG在細胞之間的水平轉移與動態分配通過以下方式實現：兩個實際接觸的細胞交換遺傳信息；噬菌體將細菌遺傳信息由供體菌向受體菌轉移；受體菌捕獲胞外DNA片段獲得遺傳信息[9]。大量研究表明水平轉移受到很多因素影響：抗生素被認為是環境中抗生素抗性基因最直接最主要的選擇壓力，研究抗生素與ARGs的豐度之間的相關性至關重要[10-12]；因為重金屬的存在促進金屬與抗生素之間的金屬橋連作用，從而可能以某種方式降低抗生素的選擇壓力和豐富度，重金屬是影響ARGs分布與遷移的重要因素[13-21]；越來越多的證據都表明可移動元件的多樣性與ARGs的多樣性之間的關系是緊密相關的，相同可移動元件的相對豐度與ARGs的相對豐度之間也具有非常顯著的相關性，可移動元件例如I類整合子intI1被發現是城市湖泊中抗生素抗性基因轉移傳播中非常重要的媒介，可移動元件還有質粒、整合子、轉座子、基因組島、整合性結合元素、插入序列、插入序列共有區、噬菌體和基因轉移劑等等，對環境中可移動元件的控制可以看作是控制ARGs傳播行之有效的途徑[22-23]；各種金屬納米顆粒對于環境中抗性基因的影響越來越顯現，例如納米氧化鋁和納米氧化鈦 可以促進ARGs的共軛轉移，銅納米顆粒可增強ARG的共軛轉移和共軛轉移頻率，金屬納米顆粒也是決定ARGs遷移的重要影響因素[24]；除了抗生素的應用之外，非抗生素抗菌化學藥品的使用量更大，導致非抗生素抗菌化學藥品在更廣泛的環境中殘留量很高，因此非抗生素抗菌化學藥品選擇微生物對抗生素的耐藥性中的潛在作用創造了必要條件[25-27]。此外，細菌群落結構和組成是ARG分布和富集的主要決定因素[28-29]。碳、氮、硫等元素是微生物生長的物質基礎，直接或間接影響和介導ARG的胞間分布：例如從糞肥到生物堆肥，土壤中發現tetW、tetQ、tetL、tetM和tetX等基因與總氮，總有機碳、水分、pH和碳氮比正相關；無機碳、溶解有機碳等理化參數通過對細菌存活的影響來介導ARGs的遷移轉化；大量研究發現垃圾填埋場的氮會顯著促進目標ARGs 的水平升高，畜禽養殖場環境介質中總氮、總磷與intl1、sul、tet Q等眾多目標基因有顯著相關性[30-33]，可見碳、氮等元素通過控制細菌的存活[34]或改變細胞膜通透性[35]影響ARG胞間分布。相比之下，硫對ARG水平轉移與胞間分布的研究十分有限，然而硫元素對微生物群落多樣性具有重要作用，僅有文獻報道硫在淹水條件下促進根際特異性耐性細菌生長而富集ARG。任何能夠引起微生物群落結構改變的因素都會在群落水平上影響ARG的分配，因此需要針對不同環境條件開展特異性研究。

2 ARG的界面吸附與滯留制約地下水污染

胞內ARG沒有直接與環境介質發生吸附與釋放，應針對ARG宿主微生物開展界面作用研究。研究表明微生物表現出復雜的界面相互作用：微生物表面性質、微生物疏水性，細胞外聚合物(例如蛋白質、脂多糖、細胞外多糖)，細胞外結構(例如菌毛和鞭毛)，細胞形狀，吸附介質表面性質、溶液理化性質通過改變微生物或吸附介質表面電荷、雙電層電位、或保留位點等，影響微生物在固-液界面吸附與釋放[36]。并且微生物的表面特性會根據細胞對環境條件的應變而變化[37]。有必要進行更多的研究以更好地量化和預測微生物尤其是ARG宿主微生物，與異質環境表面的相互作用。

環境介質中攜帶ARG的游離胞外DNA，數量遠遠多于胞內ARG[38]。不過，由于胞外DNA穩定性較差且易被天然受體菌捕獲[39]，對胞外ARG的吸附滯留研究較少。有限研究表明，pH 值對天然受體菌捕獲胞外ARG有顯著影響[40]，而間接影響胞外ARG的吸附作用。有待開展更多環境因素對胞外ARG的吸附作用的研究，還應該關注天然受體菌群與環境介質的相互作用。

3 ARG在多孔介質環境的垂向遷移導致地下水污染

胞內ARG以ARG宿主微生物為載體遷移。由于流體流動，與固-液界面弱結合的微生物受到流體動力，再次滑動或脫離，通過流體在環境介質中遷移[41]。ARG在多孔介質，如土壤和底質的移動是物理過程、地球化學過程和生物過程的耦合作用結果。有限的研究表明微生物在固-液界面上分離進而遷移受到微生物在界面的吸附解吸行為、流場水動力條件[42]和水化學條件的影響[43]。

此外，土壤或沉積物顆粒表面附著的微生物群落形成生物膜，可以保護常駐生物，免受環境壓力的影響，因此會顯著影響微生物在土壤和含水層中的傳播[44]。尚未發現微生物群落多樣性和結構對胞內ARG或宿主微生物遷移的作用研究。

由于對流運輸和抑制性DNA核酸酶的效率降低，具有生物活性的無細胞DNA，如細胞外游離的ARG可以在土壤環境中運輸[45]，且可在環境中持續長達數年的時間[46]，因此被傳遞[47]。對胞外ARG在環境中的遷移研究甚少，尤其是向地下水的垂向遷移研究更少。對ARG的阻控研究發現隨著污水通過處理流程，胞內ARG數量減少而胞外ARG數量增加[48]，垂直砂濾去除研究同樣發現胞外ARG在砂柱中的垂直遷移能力明顯高于胞內ARG[49-52]。這些研究表明無細胞的胞外ARG在自然環境具有強大的遷移擴散能力。但是，并不能證明胞外ARG的獨自遷移能力是出水中胞外ARG數量增加的唯一原因，因為在遷移過程若發生ARG的胞間轉移和再分配也會導致出水中胞外ARG數量增多。因此，有待開展多孔介質胞外ARG的垂向遷移機制研究。

4 小結與展望

為了推動礦區生態修復、土地復墾、水土資源合理開發利用，面向國家重大發展方向“全面推進采煤塌陷區改造轉型”、“開展典型受損生態系統恢復”，針對采煤塌陷地ARG污染，圍繞當地物理、化學和生物特征，環境研究領域需要了解、揭示抗生素抗性基因相關的風險，并提出遏制細菌耐藥行動的內容和重點方向，可在以下幾方面開展相關研究：

(1) 統一環境介質中ARG的豐度表達方式。可根據采用的測序技術，將絕對豐度表示為copy/cell，或根據相對豐度表示成PPM。

(2) 胞內ARG的遷移與滯留以ARG宿主細菌為載體，而胞外ARG是游離于細胞外的DNA遷移，因此，需區分細胞內ARG和細胞外ARG，明確ARG在胞間的動態分配機理，分別開展二者在環境介質的界面吸附與遷移行為研究。

(3) 雖然大量報道發現地下水受到ARG的污染，但是缺乏ARG向地下水的遷移研究，并不清楚胞內ARG和胞外ARG污染地下水的遷移路徑和機制。