耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因的超支化等溫擴增PCR檢測方法研究

董 劍，席家莊，王 杉，何建春，趙峻英*

（重慶市大足區(qū)人民醫(yī)院，重慶 402360）

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是金黃色葡萄球菌的一個獨特菌株，能抵抗所有青霉素及其他β內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物。至今MRSA感染幾乎遍及全球，成為重要的院內(nèi)感染病原菌之一[1]。MRSA的早期篩查，對臨床治療和院感防控至關重要。然而，傳統(tǒng)病原菌培養(yǎng)鑒定耗時較長、靈敏度有限、操作繁瑣，難于實現(xiàn)MRSA的早期檢測[2]。因此，急需構建具有高效、靈敏、便捷的MRSA檢測方法。本研究以mecA基因為目標基因，構建超支化等溫擴增PCR檢測方法，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

菌株為隨機抽取的我院2015年1月～2019年1月保存的經(jīng)VITEK2 Compact全自動細菌鑒定儀鑒定的MRSA 83株，甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌（MSSA）62株。

1.2 主要試劑

細菌核酸提取試劑盒、dNTPs 、Champagne Taq DNA polymerase由北京天根生物科技股份有限公司生產(chǎn)、PCR引物由上海捷瑞生物公司合成。

1.3 引物設計

根據(jù)GenBank 中發(fā)布的mecA耐藥基因序列，采用Primer 6.0設計，遵循核酸設計的原則，在保守區(qū)設計超支化等溫擴增PCR技術發(fā)卡結構H1、H2、SH1、SH2，采用Oligo 6.0進行評價。

1.4 核酸提取

按試劑盒說明書操作步驟進行細菌核酸提取

1.5 超支化等溫擴增PCR反應體系及條件

采用50 μL的反應體系，模板1～5 μL，H1、H2、SH1、SH2 1M共5 μL，dNTPs 4 μL，Buffer緩沖液5 μL，Taq酶0.25 μL，無菌雙蒸水補齊。反應條件：62℃水浴恒溫 52 min，80℃5 min10 min。

1.6 超支化等溫擴增PCR反應產(chǎn)物

取擴增產(chǎn)物10 μL與2 μL上樣緩沖液混合，加入到PAGE電泳孔，

恒流100 mA電泳，在凝膠像分析儀下觀察并記錄結果。

1.7 統(tǒng)計分析

應用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

（1）在電泳圖上含mecA基因的金黃色葡萄球菌（MRSA）被檢出，有梯狀條帶出現(xiàn)，

不含mecA基因的金黃色葡萄球菌（MSSA）不出現(xiàn)條帶，呈陰性。

（2）145株金黃色葡萄球菌兩種方法的檢測結果

145株金黃色葡萄球菌中，VITEK2 Compact全自動細菌鑒定共檢出MRSA83株，檢出率57.24%，超支化等溫擴增PCR在以上83株MRSA中全部找到mecA基因，在62株MSSA中找到3株含mecA基因，MRSA檢出率59.31%。兩種檢測方法結果比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

本研究所構建的超支化等溫鏈擴增PCR技術[3-5]，采用臨床分離的菌株進行檢測具有較好的特異性，含mecA基因的金黃色葡萄球菌可出現(xiàn)有梯狀條帶出現(xiàn)，不含mecA基因的金黃色葡萄球菌則呈陰性。對145株金黃色葡萄球菌的檢測結果來看[6-8]：超支化等溫鏈擴增PCR技術與VITEK2 Compact全自動細菌鑒定和藥敏分析儀，二者對MRSA檢出率相比差異無統(tǒng)計學意義[9-11]（P＞0.05）。兩種方法結果不一致的3株，符合率97.93%。在本研究超支化等溫鏈擴增PCR反應體系過程中僅需一個普通的恒溫水浴箱，不需昂貴的PCR儀。只需1 h左右就可得到檢測結果，相較于常規(guī)的細菌培養(yǎng)和鑒定流程時間大大縮短[12-14]，可在基層的實驗室開展。