堿性蛋白酶水解紅豆粉的工藝優化及產物抗氧化活性分析

楊 爽，董艷嬌，肖 瑜，張金寶，王 潔

（1. 吉林工程技術師范學院 食品工程學院分子營養重點實驗室，吉林長春 130052；2. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

紅豆是我國的傳統谷物之一，也是我國重要的農產品。紅豆營養價值豐富，每100 g 含有約20 g蛋白質，0.5 g 脂肪，58.5 g 糖，4.9 g 粗纖維，23.5 g膳食纖維，0.3 mg 維B1、0.11 mg 維B2[1]。紅豆被認為是一種高蛋白質、低脂肪的食物。紅豆常被加工成多種食品，如紅豆飲料[2]、酸奶[3]、酒類[4]和紅豆沙[5]等，都受到廣大消費者的喜歡。同時，紅豆也是藥用原料，在藥用價值方面研究發現，紅豆皂苷和膳食纖維具有良好的調節血壓、血糖，以及利尿、通便、解酒、預防肝硬化和結石等作用[6]。我國關于紅豆的研究主要集中在黃酮[7]、多酚[8]等多種生物活性成分提取及功能活性研究。而作為紅豆主要成分之一，紅豆蛋白質是優質的植物蛋白來源，其氨基酸種類齊全，必需氨基酸達到甚至高于FAO/WHO 的要求[9]。與此同時，其蛋白質水提物獲得的肽被證明具有抗菌、抗腫瘤[10]活性。雖然紅豆蛋白是良好的植物蛋白原料，但紅豆目前的加工程度較低，并未得到充分利用開發。

近年來，越來越多研究者通過酶水解蛋白質制備功能活性肽，來實現高效利用蛋白資源的目的。有些蛋白質其組成中部分序列無活性，經過酶解后，釋放出來某些序列，才可表現出生理活性，酶水解獲得的肽通常由2～20 個氨基酸殘基組成，且相關研究表明其水解產物在營養價值方面，其吸收和利用率優于未水解的蛋白質，更能發揮蛋白質的營養作用[11-12]。堿性蛋白酶被廣泛用于蛋白質的水解，已有報道關于綠豆肽[13]、花生肽[14]、黑豆肽[15]、大豆肽[16]等肽類的水解工藝研究和功能特性分析。我國有豐富的雜糧品種，紅豆作為我國雜糧的一個重要的品種，對其深加工研究卻是非常少。所以，試驗以堿性蛋白酶對紅豆粉進行水解并對其水解產物抗氧化活性進行分析。試驗結果可為進一步開發紅豆和紅豆水解物的應用提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅豆，購自超市，蛋白質含量測定為21.6%；堿性蛋白酶（酶的活力數值為1.0×105U/mL），豐瑞生物科技有限公司提供；氫氧化鈉、鹽酸等，均為分析純。

粉碎機，速鋒有限公司產品；HH-W600 型恒溫水浴鍋，安慶潔佳儀設備有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗流程

紅豆→機器粉碎→過篩120 目→調節溫度、pH 值、加酶量和酶解時間→水解→沸水浴滅酶10 min→測水解度。

1.2.2 紅豆肽的酶解工藝

（1） 單因素試驗。①溫度。固定質量分數為20%，酶加入量250 U/mL，時間3.5 h，在pH 值為10.0 的條件下，于45，50，55，60，65 ℃的水浴溫度環境中酶解，測定水解度。②pH 值。固定質量分數為20%，酶加入量250 U/mL，時間3.5 h，溫度55 ℃，測定不同的pH 值（7.0，8.0，9.0，10.0，11.0）條件下水解度。③加酶量。固定質量分數為20%，在pH 值為10.0，時間3.5 h，溫度為55 ℃的條件下，測定不同加酶量（100，150，200，250，300 U/mL） 條件下水解度。④時間。固定質量分數為20%，pH 值10.0，溫度55 ℃，加酶量250 U/mL，再以時間2.5，3.0，3.5，4.0，4.5 h 分別測定水解度。

（2） 正交試驗。以水解度作為評價指標，以下的4 個因素（溫度、pH 值、加酶的量和時間） 為自變量，選擇四因素三水平的設定，在單因素試驗的基礎上進行正交試驗，從而進一步優化水解條件。

正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設計

（3） 蛋白水解度（DH） 的測定。參考袁斌等人[17]的方法，用pH-stat 法測水解度，計算如下：

式中：B——氫氧化鈉用量；

Nb——氫氧化鈉質量濃度，mg/mL；

α——校正系數，計算如下：

pK 隨溫度變化，根據Gibbs-Helmholz 方程計算獲得；

式中：Mp——底物蛋白質質量，mg；

Htot——每克蛋白質底物的肽鍵毫摩爾數，紅豆蛋白為7.12。

（4） 水解物的制備。水解結束后，取出沸水浴滅酶10 min，以轉速5 000 r/min 離心20 min，取上清液冷凍干燥后密封保存于-20 ℃冰箱中，用于后續試驗。

（5） 抗氧化性的測定。

①DPPH 自由基的清除能力。根據Xia Y 等人[18]的方法略作修改，分別配置2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取0.5 mL 樣品液加0.1 mmol/L DPPH 無水乙醇0.5 mL，避光反應30 min，于波長517 nm 處測定吸光度，無水乙醇DPPH 為對照，空白為無水乙醇。計算公式如下：

式中：As——樣品吸光度；

Ab——空白吸光度；

Ac——對照吸光度。

②羥基自由基（·OH） 清除能力。參考Halliwell B[19]的方法，分別配置2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取0.5 mL 加0.5 mol/L FeSO4和H2O2反 應10 min，加0.5 mL 6.0 mmol/L 水楊酸靜置30 min，于波長510 nm測定吸光度（As），去離子水為空白（Ab），水楊酸和樣品為對照（Ac）。計算公式如下：

式中：As——樣品吸光度；

Ab——空白吸光度；

Ac——對照吸光度。

③還原力測定。參考Lu R R 等人[20]的方法，分別配置2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取0.5 mL 樣品液，配制成質量分數為1%的鐵氰化鉀溶液，于50 ℃下反應20 min，加10%的三氯乙酸終止反應，以轉速4 000 r/min 離心10 min，取0.5 mL 上清液加等體積去離子水，加0.1% FeCl3溶液0.4 mL （W/V），在50 ℃下反應10 min，于波長700 nm 處測定吸光度為還原力，空白為去離子水。

④Fe2+螯合能力。分別配置質量濃度為2，4，6 mg/mL 樣品溶液，取1 mL 加2.0 mL 氯化亞鐵和菲洛嗪反應10 min，于波長562 nm 處測定吸光度（As）。去離子水代替樣品為空白（Ac），計算公式如下：

1.3 統計學分析

每個試驗至少做3 次平行試驗，結果表示為平均值±標準差。試驗數據采用SPSS 22.0 軟件進行方差分析與相關性分析，使用OriginPro 8.5 軟件制作分析圖表。

2 結果與分析

2.1 酶解溫度對水解度的影響

酶解溫度對蛋白水解度的影響見圖1。

由圖1 可以看出，酶解溫度在45～55 ℃，水解度隨酶解溫度升高而增大，當酶解溫度大于55 ℃之后，隨著酶解溫度提高水解度發生了降低的情況。出現這種情況是因為酶的活性和溫度有關[21]，當溫度高于酶的最適反應溫度，酶的活性降低。

2.2 pH 值對蛋白水解度的影響

pH 值對蛋白水解度的影響見圖2。

由圖2 可以看出，隨著pH 值的增大，水解度在圖中總體看來呈現上升趨勢，酶的反應活性強度和pH 值的大小是有關系的。如圖2 所表現的pH 值為11 時，水解度到達了試驗的最大值為19%，并逐漸趨于平緩。綜合考慮生產成本及實際生產所需條件，后續正交試驗選擇的pH 值為9～11。

2.3 加酶量對水解度的影響

加酶量對蛋白水解度的影響見圖3。

由圖3 可以看出，隨加酶量的增大，水解度也在圖中總體出現增大的變化。在加酶量100～250 U/mL下，隨著酶量增加水解度不斷增加。而當加酶量為300 U/mL，水解度降低，這說明加酶量過大時不利于水解反應，產物中可能存在抑制酶作用的成分[22]，反應不再進行，從而使水解度發生下降。

2.4 酶解時間對水解度的影響

酶解時間對蛋白水解度的影響見圖4。

由圖4 可以看出，酶解時間對水解度有明顯的影響（p＜0.05），在2.5～3.5 h 時，水解度隨酶解時間的延長逐漸增加；在3.5 h 時，水解度最高為17.8%。而進一步延長酶解時間，水解度不再增大而是出現降低現象。

2.5 最佳酶解工藝條件的確定

正交試驗結果見表2。

由表2 可以看出，在測定影響水解度的因素試驗中，4 個因素對水解度的影響主要程度依次為酶用量＞pH 值＞時間＞溫度。由正交試驗數據極差分析可知，最好的組合是A2B3C2D2，但表2 中4 號試驗組A2B1C2D3的結果是最高的，為19.4%，和優選組合不一致，然后用優選組合的結果A2B3C2D2與第4 號組進行再一次的試驗求證，求證結果顯示優選組合方案A2B3C2D2水解度是20.67%，所以最好的組合是A2B3C2D2，即溫度55 ℃，pH 值11，加酶量250 U/mL和時間3.5 h，最適用于紅豆的水解。

表2 正交試驗結果

2.6 抗氧化活性

不同質量濃度水解物見圖5。

不同質量濃度樣品均顯示了對DPPH 自由基有良好的清除能力（20.95%～33.09%），且樣品質量濃度與DPPH 自由基清除率密切相關。羥基自由基可激活脂質過氧化反應，與幾乎所有相鄰的生物分子可發生反應。這種損傷可導致多種疾病，因此它的清除是預防食物腐敗和某些疾病發生的最有效的方法之一[22]。紅豆水解物具有較強的羥基自由基清除能力（30.91%～54.6%），可用于預防食物腐敗，使其免受羥基氧化的危害。圖5（c）中顯示了紅豆水解物Fe2+螯合能力，Fe2+螯合能力隨著質量濃度增加，從15.94%增加到30.01% （p＜0.05）。紅豆水解物具有較好的金屬離子結合能力。圖5（d） 顯示了水解物的還原力，如圖所示，紅豆水解物具有一定的還原能力（0.17%～0.3%），高于大麥谷蛋白酶解獲得的水解產物還原力（0.121，2 mg/mL）[18]。以上結果表明，紅豆水解物具有良好的抗氧化能力，且抗氧化活性與質量濃度相關。

3 結論

選擇堿性蛋白酶水解紅豆，制備水解物，并分析其水解產物抗氧化活性，以期提高紅豆資源利用率。結果表明，堿性蛋白酶最適水解條件為溫度55 ℃，pH 值11，加酶量250 U/mL 和酶解時間3.5 h，此時蛋白水解度20.67%。在此參數下獲得的水解物的DPPH 自由基清除能力、羥基自由基清除能力、Fe2+螯合力和還原能力，隨質量濃度的增加而增強，表明堿性蛋白酶水解紅豆獲得的水解物具有較好的抗氧化活性，其可作為一種潛在的抗氧化多肽進行開發。