響應(yīng)面法優(yōu)化保加利亞乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基的氮源

李曉軍，馬躍英，郭躍東，王海霞，馮 謙，邢會霞，馬曉紅，李康寧，黃少磊， 劉彥民

（內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010010）

“金雙歧” 是內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司主導(dǎo)產(chǎn)品，是內(nèi)蒙古自治區(qū)成立70 年來，企業(yè)自主研發(fā)并擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的唯一一個國家一類新生物制品，其療效確切，安全無毒副作用。金雙歧所含3 種菌粉，長雙歧桿菌菌粉、保加利亞乳桿菌菌粉、嗜熱鏈球菌菌粉均為公司自行研制生產(chǎn)。隨著 “金雙歧” 銷量的逐年遞增，金雙歧中3 種菌粉的生產(chǎn)需求量也隨之增加，菌粉的產(chǎn)能由菌粉活菌數(shù)決定，而3 種菌粉中，保加利亞乳桿菌由于真空冷凍干燥后的菌體存活率比較低，導(dǎo)致菌粉活菌數(shù)相對較低，產(chǎn)能較其他菌粉落后。因此，將對保加利亞乳桿菌菌粉活菌數(shù)開展優(yōu)化研究。大部分研究人員通過尋找最適的高密度培養(yǎng)方法來提高保加利亞乳桿菌發(fā)酵液活菌數(shù)，從而提高菌粉活菌數(shù)，或者通過優(yōu)化保護(hù)劑配方來提高菌粉活菌數(shù)，亦或是兩者相結(jié)合的方式[1-4]。都容易忽視發(fā)酵工藝對保加利亞乳桿菌抗凍性的重要影響，其中保加利亞乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分與其在冷凍干燥過程中的存活率有著十分密切的聯(lián)系[5-8]。培養(yǎng)基組分中碳氮源是最主要的影響因素，選擇合適的碳氮源可增加細(xì)胞膜中不飽和脂肪酸的含量，從而增加菌體細(xì)胞膜的流動性，使得菌體的抗凍性得到提高[9]。另外，不同碳氮源會影響菌體的形態(tài)，形態(tài)的改變也會引起抗凍性的改變[10]。以保加利亞乳桿菌為出發(fā)菌株，通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計，篩選出顯著影響真空冷凍干燥后菌體細(xì)胞存活率的氮源物質(zhì)，然后利用響應(yīng)面方法優(yōu)化所選有機(jī)氮源的復(fù)配比例，以期得到可提高凍干存活率的最優(yōu)氮源組合。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 供試菌種保加利亞乳桿菌NQ2508，內(nèi)蒙古雙奇藥業(yè)股份有限公司技術(shù)中心保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良MRS 培養(yǎng)基：酪蛋白胨4 g，牛肉膏8 g，葡萄糖12 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000 mL，pH 值6.6。

MRS 檢測培養(yǎng)基：在以上改良MRS 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入瓊脂粉15 g。

凍干保護(hù)劑配方：脫脂乳200 g，乳糖12 g，谷氨酸鈉10 g，抗壞血酸10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

牛肉膏、牛肉浸粉、酵母粉、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨，榮氏生物制品（蘇州） 有限公司提供。

1.1.4 儀器及設(shè)備

J2-21 型離心機(jī)、BCN-1360 型超凈臺、1029 型厭氧培養(yǎng)箱、 2014-025Bb 型真空冷凍干燥機(jī)、PB-10 型酸度計等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的培養(yǎng)及凍干

將保加利亞乳桿菌菌種在MRS 液體培養(yǎng)基中活化2 代后，按5%的接種量分別接種于含不同氮源物質(zhì)的MRS 培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)箱于37 ℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)至對數(shù)生長后期時，各發(fā)酵液于4 ℃下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，離心得到的菌體以2 倍質(zhì)量的保護(hù)劑懸浮，然后進(jìn)行真空冷凍干燥（預(yù)凍：-40 ℃，2 h；升華干燥：-30～-8 ℃，8 h；解析干燥：8～25 ℃，4 h）。得到的凍干粉進(jìn)行活菌數(shù)檢測，并計算菌體凍干存活率。菌體凍干存活率的計算方法為：

1.2.2 試驗(yàn)設(shè)計

以保加利亞乳桿菌真空冷凍干燥后菌體凍干存活率為響應(yīng)值，首先利用Plackett-Burman 設(shè)計法從各氮源物質(zhì)因素中篩選出顯著影響因素，再利用響應(yīng)面方法（RSM） 中的Box-Behnken 設(shè)計進(jìn)行試驗(yàn)，通過試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到二階響應(yīng)面模型，最終確定最優(yōu)氮源物質(zhì)組成，并進(jìn)行驗(yàn)證。用Design Expert 8.0 軟件作為試驗(yàn)設(shè)計和數(shù)據(jù)分析的軟件工具。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計篩選顯著影響因素

選定N=12 的Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計，對酪蛋白胨、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等6 個因素進(jìn)行顯著性影響因子篩選，各因素均取2 個水平：高水平 “+” 和低水平 “-”。

Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平見表1，Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果見表2，Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計各因素的方差分析見表3。

表1 Plackett-Burman 試驗(yàn)因素水平

表3 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計各因素的方差分析

由表3 的方差分析可以看出，對保加利亞乳桿菌凍干存活率有顯著影響的氮源依次是酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉，其他因素均不顯著。這3 個因素的估計系數(shù)均為正值，說明試驗(yàn)中所定的這3 種氮源質(zhì)量濃度有些偏低，下一步優(yōu)化中應(yīng)適當(dāng)?shù)靥岣邼舛取?/p>

2.2 Box-Behnken 優(yōu)化設(shè)計結(jié)果與響應(yīng)面分析

選用三因素三水平， 17 個試驗(yàn)點(diǎn)的Box-Behnken 設(shè)計，其中5 個為中心點(diǎn)。

Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計因素與水平設(shè)計見表4，Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果見表5。

表4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計因素與水平設(shè)計

表5 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計結(jié)果

對表5 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，得到的二次方程模型為：

Y=90.35+2.56A+6.45B+3.54C+2.37AB-2.64AC-2.16BC-3.86A2-4.92B2-1.16C2.

式中： Y——響應(yīng)值菌體凍干存活率，%；

A，B，C——分別代表酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的添加質(zhì)量濃度，g/mL。

響應(yīng)面回歸方程方差分析見表6。

表6 響應(yīng)面回歸方程方差分析

由表6 可知，多元相關(guān)系數(shù)R2=99.49，說明模型對實(shí)際情況的擬合度很好。模型項(xiàng)p 值（Prob＞F）＜0.000 1，說明模型顯著，可用來進(jìn)行響應(yīng)值預(yù)測。一次項(xiàng)、二次項(xiàng)的F 檢驗(yàn)均極顯著，說明所選擇的酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉3 種因素對菌體凍干存活率的影響都極顯著；由交互項(xiàng)的F 檢驗(yàn)可知酵母粉與酪蛋白胨、酵母粉與牛肉浸粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉對菌體凍干存活率影響的交互作用極顯著。

酵母粉和酪蛋白胨對菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖見圖1，酵母粉和牛肉浸粉對菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖見圖2，牛肉浸粉和酪蛋白胨對菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應(yīng)面圖見圖3。

圖1 ～圖3 是多元回歸方程式所做的等高線圖和響應(yīng)面圖，由此可對任何兩因素交互影響菌體凍干存活率進(jìn)行分析與評價，以確定最佳因素水平范圍。通過軟件計算得到，酵母粉質(zhì)量濃度0.46 g/100 mL，酪蛋白胨質(zhì)量濃度0.52 g/100 mL，牛肉浸粉質(zhì)量濃度0.93 g/100 mL 時，預(yù)測菌體凍干存活率最大值為93.75%。以篩選出的最佳質(zhì)量濃度配比，做3 組重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，平均菌體存活率為92.98%，與預(yù)測值非常接近，說明通過響應(yīng)面法建立的數(shù)學(xué)模型準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

通過Plackett-Burman 試驗(yàn)研究了各種氮源物質(zhì)對菌體凍干存活率的影響程度，結(jié)果表明酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉對保加利亞乳桿菌的凍干存活率具有顯著性影響。通過Box-Behnken 設(shè)計試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化了氮源組成，即當(dāng)酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的質(zhì)量濃度分別為0.46，0.52，0.93 g/100 mL 時，凍干后保加利亞乳桿菌具有最大存活率為93.75%，實(shí)測值平均為92.98%，與理論預(yù)測值較為接近。說明該模型準(zhǔn)確可靠，具有實(shí)際應(yīng)用意義，為保加利亞乳桿菌培養(yǎng)基的進(jìn)一步優(yōu)化奠定了良好的基礎(chǔ)。