響應面法優化保加利亞乳桿菌發酵培養基的氮源

李曉軍，馬躍英，郭躍東，王海霞，馮 謙，邢會霞，馬曉紅，李康寧，黃少磊， 劉彥民

（內蒙古雙奇藥業股份有限公司，內蒙古呼和浩特 010010）

“金雙歧” 是內蒙古雙奇藥業股份有限公司主導產品，是內蒙古自治區成立70 年來，企業自主研發并擁有自主知識產權的唯一一個國家一類新生物制品，其療效確切，安全無毒副作用。金雙歧所含3 種菌粉，長雙歧桿菌菌粉、保加利亞乳桿菌菌粉、嗜熱鏈球菌菌粉均為公司自行研制生產。隨著 “金雙歧” 銷量的逐年遞增，金雙歧中3 種菌粉的生產需求量也隨之增加，菌粉的產能由菌粉活菌數決定，而3 種菌粉中，保加利亞乳桿菌由于真空冷凍干燥后的菌體存活率比較低，導致菌粉活菌數相對較低，產能較其他菌粉落后。因此，將對保加利亞乳桿菌菌粉活菌數開展優化研究。大部分研究人員通過尋找最適的高密度培養方法來提高保加利亞乳桿菌發酵液活菌數，從而提高菌粉活菌數，或者通過優化保護劑配方來提高菌粉活菌數，亦或是兩者相結合的方式[1-4]。都容易忽視發酵工藝對保加利亞乳桿菌抗凍性的重要影響，其中保加利亞乳桿菌發酵培養基組分與其在冷凍干燥過程中的存活率有著十分密切的聯系[5-8]。培養基組分中碳氮源是最主要的影響因素，選擇合適的碳氮源可增加細胞膜中不飽和脂肪酸的含量，從而增加菌體細胞膜的流動性，使得菌體的抗凍性得到提高[9]。另外，不同碳氮源會影響菌體的形態，形態的改變也會引起抗凍性的改變[10]。以保加利亞乳桿菌為出發菌株，通過Plackett-Burman試驗設計，篩選出顯著影響真空冷凍干燥后菌體細胞存活率的氮源物質，然后利用響應面方法優化所選有機氮源的復配比例，以期得到可提高凍干存活率的最優氮源組合。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 供試菌種保加利亞乳桿菌NQ2508，內蒙古雙奇藥業股份有限公司技術中心保存。

1.1.2 培養基

改良MRS 培養基：酪蛋白胨4 g，牛肉膏8 g，葡萄糖12 g，K2HPO42 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，吐溫-80 1 mL，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，碳酸鈣2g，蒸餾水1000 mL，pH 值6.6。

MRS 檢測培養基：在以上改良MRS 培養基的基礎上加入瓊脂粉15 g。

凍干保護劑配方：脫脂乳200 g，乳糖12 g，谷氨酸鈉10 g，抗壞血酸10 g，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 試劑

牛肉膏、牛肉浸粉、酵母粉、牛肉蛋白胨、大豆蛋白胨、酪蛋白胨，榮氏生物制品（蘇州） 有限公司提供。

1.1.4 儀器及設備

J2-21 型離心機、BCN-1360 型超凈臺、1029 型厭氧培養箱、 2014-025Bb 型真空冷凍干燥機、PB-10 型酸度計等。

1.2 試驗方法

1.2.1 保加利亞乳桿菌的培養及凍干

將保加利亞乳桿菌菌種在MRS 液體培養基中活化2 代后，按5%的接種量分別接種于含不同氮源物質的MRS 培養基中，厭氧培養箱于37 ℃下培養。培養至對數生長后期時，各發酵液于4 ℃下以轉速8 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，離心得到的菌體以2 倍質量的保護劑懸浮，然后進行真空冷凍干燥（預凍：-40 ℃，2 h；升華干燥：-30～-8 ℃，8 h；解析干燥：8～25 ℃，4 h）。得到的凍干粉進行活菌數檢測，并計算菌體凍干存活率。菌體凍干存活率的計算方法為：

1.2.2 試驗設計

以保加利亞乳桿菌真空冷凍干燥后菌體凍干存活率為響應值，首先利用Plackett-Burman 設計法從各氮源物質因素中篩選出顯著影響因素，再利用響應面方法（RSM） 中的Box-Behnken 設計進行試驗，通過試驗數據擬合得到二階響應面模型，最終確定最優氮源物質組成，并進行驗證。用Design Expert 8.0 軟件作為試驗設計和數據分析的軟件工具。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗設計篩選顯著影響因素

選定N=12 的Plackett-Burman 試驗設計，對酪蛋白胨、牛肉浸粉、大豆蛋白胨、牛肉蛋白胨、牛肉膏、酵母粉等6 個因素進行顯著性影響因子篩選，各因素均取2 個水平：高水平 “+” 和低水平 “-”。

Plackett-Burman 試驗因素水平見表1，Plackett-Burman 試驗設計結果見表2，Plackett-Burman 試驗設計各因素的方差分析見表3。

表1 Plackett-Burman 試驗因素水平

表3 Plackett-Burman 試驗設計各因素的方差分析

由表3 的方差分析可以看出，對保加利亞乳桿菌凍干存活率有顯著影響的氮源依次是酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉，其他因素均不顯著。這3 個因素的估計系數均為正值，說明試驗中所定的這3 種氮源質量濃度有些偏低，下一步優化中應適當地提高濃度。

2.2 Box-Behnken 優化設計結果與響應面分析

選用三因素三水平， 17 個試驗點的Box-Behnken 設計，其中5 個為中心點。

Box-Behnken 試驗設計因素與水平設計見表4，Box-Behnken 試驗設計結果見表5。

表4 Box-Behnken 試驗設計因素與水平設計

表5 Box-Behnken 試驗設計結果

對表5 的試驗數據進行二次回歸擬合，得到的二次方程模型為：

Y=90.35+2.56A+6.45B+3.54C+2.37AB-2.64AC-2.16BC-3.86A2-4.92B2-1.16C2.

式中： Y——響應值菌體凍干存活率，%；

A，B，C——分別代表酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的添加質量濃度，g/mL。

響應面回歸方程方差分析見表6。

表6 響應面回歸方程方差分析

由表6 可知，多元相關系數R2=99.49，說明模型對實際情況的擬合度很好。模型項p 值（Prob＞F）＜0.000 1，說明模型顯著，可用來進行響應值預測。一次項、二次項的F 檢驗均極顯著，說明所選擇的酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉3 種因素對菌體凍干存活率的影響都極顯著；由交互項的F 檢驗可知酵母粉與酪蛋白胨、酵母粉與牛肉浸粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉對菌體凍干存活率影響的交互作用極顯著。

酵母粉和酪蛋白胨對菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應面圖見圖1，酵母粉和牛肉浸粉對菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應面圖見圖2，牛肉浸粉和酪蛋白胨對菌體凍干存活率影響的等高線圖及響應面圖見圖3。

圖1 ～圖3 是多元回歸方程式所做的等高線圖和響應面圖，由此可對任何兩因素交互影響菌體凍干存活率進行分析與評價，以確定最佳因素水平范圍。通過軟件計算得到，酵母粉質量濃度0.46 g/100 mL，酪蛋白胨質量濃度0.52 g/100 mL，牛肉浸粉質量濃度0.93 g/100 mL 時，預測菌體凍干存活率最大值為93.75%。以篩選出的最佳質量濃度配比，做3 組重復驗證試驗，平均菌體存活率為92.98%，與預測值非常接近，說明通過響應面法建立的數學模型準確可靠。

3 結論

通過Plackett-Burman 試驗研究了各種氮源物質對菌體凍干存活率的影響程度，結果表明酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉對保加利亞乳桿菌的凍干存活率具有顯著性影響。通過Box-Behnken 設計試驗進一步優化了氮源組成，即當酵母粉、酪蛋白胨和牛肉浸粉的質量濃度分別為0.46，0.52，0.93 g/100 mL 時，凍干后保加利亞乳桿菌具有最大存活率為93.75%，實測值平均為92.98%，與理論預測值較為接近。說明該模型準確可靠，具有實際應用意義，為保加利亞乳桿菌培養基的進一步優化奠定了良好的基礎。