澤瀉總三萜對脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的保護作用

黃小強 ，朱懷昌 ，許 文 ，吳水生 ，黃 濤 ，賈 安 *

（1.福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122；2.黃河科技學院醫學院，河南 鄭州 450063）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是一種常見的臨床綜合癥，其致傷因素主要分為間接因素和直接因素（包括機械因素、化學因素、生物因素）導致的急性進行性呼吸功能不全或呼吸衰竭癥狀，具有較高的發病率和病死率［1-2］，研究統計 ALI 致死率高達 30%～50%［3］。 目前，臨床上常用機械通氣、激素和抗炎藥物治療，但存在著明顯缺陷，如條件限制、難以推廣、藥物毒副作用明顯、預后差等［4］，因此開發一種安全有效的防治ALI 藥物尤為迫切。

澤瀉來源于澤瀉科澤瀉屬植物澤瀉［Alisma orientale （Sam.） Juzep.］的干燥塊莖，其性寒，味甘，具有利濕、清熱、化濁降脂等功效［5-6］，主產于福建、江西、四川等地，其中福建產澤瀉最為優質，為福建著名道地藥材。 現代藥理學研究表明：澤瀉具有抗炎、利尿、降血糖、調節血脂等藥理作用［7-10］。研究發現澤瀉主要化學成分是三萜類化合物［11］，課題組前期開展了澤瀉總三萜部位的富集純化工藝研究，得到總萜含量達到50%以上的三萜部位，同時課題組通過體內和體外炎癥模型證明了澤瀉總三萜具有抗炎作用［7］，但對 ALI 的研究尚未見報道。 本研究主要是探究澤瀉總三萜對ALI 的保護作用，為澤瀉總三萜防治ALI 的藥物研發提供實驗依據。

1 材 料

1.1 儀器 多功能酶標儀（奧地利Infinite 公司）；高速臺式冷凍離心機（美國賽默飛世爾科技有限公司）；FY135 型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DHP-9052 電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）；BS-3000A 系列電子天平（上海友聲衡器有限公司）；光學顯微鏡（日本OLYMPUS 公司）；RM2125 型石蠟切片機（德國Leica 公司）。

1.2 藥品與試劑 澤瀉飲片購自福建金山醫藥集團，經福建中醫藥大學藥學院范世明高級實驗師鑒定，為澤瀉科植物澤瀉 Alisma orientale（Sam.）Juzep.，樣品寄存在福建中醫藥大學藥學院標本室。 脂多糖（LPS，美國 Sigma 公司，貨號：L2630，規格：10 mg／支）；地塞米松片（廣東南國藥業有限公司，規格：0.75 mg／片）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（上海西塘生物科技有限公司）；髓過氧化物酶（MPO）活性檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 動物 60 只SPF 級 KM 小鼠，雌雄各半，體質量18～20 g，購自上海史萊克實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（滬）2018-0006，飼養于福建中醫藥大學動物實驗中心SPF 級動物房，使用合格證號：SYXK（閩）2014-0005。飼養環境：溫度 21～23℃，相對濕度55%～75%，明暗各12 h，適應性飼養7 d后用于實驗。

2 方 法

2.1 藥物制備

2.1.1 澤瀉總三萜的制備 參考課題組前期研究澤瀉總三萜的制備方法［11］制備成濃度為2.5、5.0、10.0 mg／mL，即低、中、高 3 種濃度澤瀉總三萜，備用。

2.1.2 地塞米松溶液的制備 將地塞米松片研成細粉末，溶于水中，制備成質量濃度0.000 5 g／mL 的溶液，備用。

2.2 分組與給藥 將60 只小鼠適應性飼養1 周后，隨機分為正常組，模型組，地塞米松組，澤瀉總三萜低、中、高劑量組（簡稱低、中、高劑量組），每組10 只。低、中、高劑量組分別以 25、50、100 mg／kg 澤瀉總三萜灌胃，地塞米松組以5 mg／kg 地塞米松進行灌胃，正常組和模型組予等量常溫生理鹽水灌胃，每天1 次，連續給藥14 d。 末次給藥后2 h，剔除小鼠頸部正中毛發，酒精消毒，正中切開頸部皮膚，深度約2 cm，暴露并分離氣管，采用樣品進樣器于氣管內慢慢滴注 LPS 生理鹽水溶液（0.5 mL／kg），正常組采用同樣方法給予相應體積的生理鹽水，滴注結束后消毒并縫合皮膚［12］。 禁食不禁水，造模12 h后，小鼠眼眶采血，隨后處死小鼠，迅速取出小鼠的肺組織，備用。

2.3 小鼠肺組織濕／干重比值（W／D）測定 參考文獻［13］，取右肺上葉，除去結締組織，用濾紙吸干表面水分和血液，稱量得到肺組織濕重；隨后將肺組織放置在80 ℃恒溫干燥箱中連續干燥48 h 以上，稱量肺組織干重并記錄，計算（W／D）：

W／D＝肺組織濕重／肺組織干重×100%

2.4 小鼠肺組織中MPO 活性測定 取適量小鼠肺組織于組織勻漿器中，加生理鹽水并在冰水浴中進行研磨，離心得上清液，按照MPO 試劑盒說明書檢測肺組織中MPO 活性。

2.5 小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量測定

取血液樣本，3 000 r／min 離心 10 min，取上清，按照試劑盒說明書步驟，采用ELISA 法測定小鼠血清中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量。

2.6 肺組織病理學檢查 取右肺下葉固定于10%中性甲醛溶液中，24 h 后取出，使用蒸餾水沖洗至無味；然后對其進行常規的脫水、浸蠟、包埋、切片、蘇木素-伊紅染色、封片，在顯微鏡下對其進行病理學觀察，并進行病理學評分。 評分標準參考文獻［14］，包括肺泡壁厚度、 肺組織破壞和炎癥細胞浸潤，每個指標按5 分制評分：0 分為最小損傷，1 分為輕度損傷，2 分為中度損傷，3 分為重度損傷，4 分為最大損傷。 肺損傷評分為3 個指標評分之和。

2.7 統計學方法 采用SPSS 22.0 軟件進行數據處理。 計量資料符合正態分布的以（±s）表示，采用單因素方差分析檢驗。

3 結 果

3.1 各組小鼠肺組織W／D 比較 見表1。

表1 各組小鼠肺組織 W／D 比較（±s）

表1 各組小鼠肺組織 W／D 比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

W／D 3.76±0.60 5.94±0.501）4.05±0.493）5.78±0.37 5.26±0.592）4.10±0.623）組別正 常 組模 型 組地塞米松組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10

3.2 各組小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺組織中MPO 活性比較 見表2。

表2 各組小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺組織中 MPO 活性比較（±s）

表2 各組小鼠血清中 TNF-α、IL-6、IL-1β 含量和肺組織中 MPO 活性比較（±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別正 常 組模 型 組地塞米松組低劑量組中劑量組高劑量組n 10 10 10 10 10 10 TNF-α／（pg／mL）241.28±57.47 682.32±113.891）426.68±89.903）636.11±109.70 558.40±100.242）531.05±81.173）IL-6／（pg／mL）59.33±18.06 212.45±45.201）103.98±20.553）177.94±24.902）163.23±38.512）150.77±32.113）IL-1β／（pg／mL）77.43±12.16 316.45±39.051）183.97±31.643）287.94±25.63 273.23±36.792）260.77±24.333）MPO ／（U／g）2.42±0.59 5.72±0.701）4.51±0.693）5.41±0.68 5.07±0.542）4.83±0.523）

3.3 各組小鼠肺組織病理形態學和肺損傷評分比較 見圖1、圖2。

4 討 論

ALI 是臨床常見的一種嚴重疾病，其發病機制復雜，發生迅速，死亡率高［15］。革蘭陰性菌感染導致肺炎時是ALI 最常見的誘導因素，LPS 是革蘭氏陰性菌外膜的一種成分，同時也是主要致病物質［16］。LPS 刺激能夠活化巨噬細胞，誘導機體釋放大量TNF-α、IL-1β 和 IL-6 等炎癥因子，進而引發急性炎癥［17］。雖然目前關于ALI 的致病機制尚不清楚，但是大量研究報道認為，肺組織的炎癥反應失衡是導致ALI 發生的根本原因［18］。地塞米松屬于糖皮質激素，具有強大的抗炎、抗過敏作用，可較好地減輕由ALI 所致的肺損傷［19］，因此本研究以地塞米松為陽性對照。 本研究結果顯示澤瀉總三萜能夠顯著性降低 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 炎癥因子，提示澤瀉總三萜保護LPS 誘導的急性肺損傷與抑制炎癥因子分泌有關。

肺組織的 W ／D 可反映肺水腫程度［20］。 本研究結果顯示澤瀉總三萜能夠顯著降低W／D，減輕LPS所誘導的ALI。 此外，本研究結果顯示模型組小鼠肺組織損傷嚴重，可見彌漫性肺水腫，肺泡壁和肺泡間隔明顯增寬，大量炎癥細胞浸潤，而給予澤瀉總三萜后上述病理變化明顯減輕。

總之，澤瀉總三萜能夠降低W／D 和MPO 活性，同時也能夠降低血清中 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 炎癥因子含量，提示澤瀉總三萜對LPS 所致的急性肺損傷具有一定的保護作用，其作用機制與澤瀉總三萜抑制細胞炎癥因子分泌有關。

圖1 各組大鼠肺組織病理形態學光鏡圖（×200）

圖2 各組大鼠肺損傷評分柱狀圖