miR-21 在原發(fā)性肝癌組織中的表達及對細胞生物學行為的影響

汪旭偉， 馬沛

（河南省南陽市第一人民醫(yī)院 普外一科， 河南 南陽473000）

microRNAs （miRNAs） 是一類在轉錄后與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關的小分子、 非編碼 RNA［1］。 近年來 miR－21 被證實在直腸癌、 宮頸癌、 肝癌等癌癥組織中呈異常表達， 但其具體調(diào)控機制尚未完全明確。 研究［2］表明， 我國每年肝癌患者新增超40 萬例， 且發(fā)病率仍逐年上升， 故而進一步探尋肝癌組織中 miR－21 的調(diào)控機制意義重大。 目前已有研究［3］顯示 miR－21 在肝癌組織中呈異常表達水平， 但針對其異常表達后對肝癌細胞的增殖、 轉移等癌癥組織的重要生物學特征仍鮮有報道。基于此， 本研究通過觀察肝癌組織、 癌旁組織中miR－21 的表達水平， 并構建低表達、 高表達miR－21 肝癌細胞株， 以期探尋miR－21 對原發(fā)性肝癌細胞增殖、 轉移和侵襲的調(diào)控機制，為后續(xù)臨床病情判斷和治療方案制定提供參考， 現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取 2014 年 7 月至 2019 年 3 月我院收治的原發(fā)性肝癌患者100 例， 分離其肝癌組織和癌旁組織， 取材后迅速將樣本置于液氮中待測。

1.2 細胞株和主要試劑

1.2.1 試劑和儀器 Has-miR－21 inhibitor 和 Hsa－miR－21 mimics（Biomics Biotech）， 胰蛋白酶、 DMEM 培養(yǎng)液 （上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司）， 胎牛血清 （賽默飛旗下 Gibco）； RNA 提取試劑、 Lipo－2000 轉染試劑盒 （賽默飛）， Takara 反轉錄試劑盒 （北京綠源伯德）， 低溫離心機 （浙江三聯(lián)環(huán)保科技股份有限公司）， 超低溫冰箱 （廣州傲雪）， UNIVERSAL 320／320R 冷凍離心機 （美國貝克曼）。

1.2.2 HepG2 細胞培養(yǎng)和傳代 自事先保存樣本的液氮中取出HepG2 細胞凍存管， 水浴融化后移至15 mL 離心管中， 隨后離心分離上清液， 在5% CO2、 37 ℃含10%胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 待細胞株生長密度為90%時進行傳代， 首先將洗滌后的細胞經(jīng)0.25%胰酶消化， 隨后采用4 mL DMEM 培養(yǎng)基中斷細胞消化， 并采用倒置顯微鏡下觀察， 最后以50%的接種密度將細胞接種于 6 孔板， 并依據(jù)操作手冊分別采用 Has-miR-21 inhibitor （ 100 nm／L） + Lipofectamine 2000， Hsa -miR -21 mimics （50 nm／L） + Lipofectamine 2000 進行轉染。

1.3 細胞增殖檢測采用MTT 法將增強組、 抑制組按每孔 1 ×103個分別接種于96 孔板中。 培養(yǎng) 7 d 后加入MTT 測定液10 μL， 37 ℃孵育 2 h， 隨后采用酶標儀在 450 nm 波長處測定吸光度值， 并計算肝癌細胞株增殖情況。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)， 計量資料以表示， 行 t 檢驗， P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織與癌旁正常組織miR－21 及MAP2K3 表達水平比較qPCR 檢測結果顯示， 癌旁正常組織、 肝癌組織的miR-21表達量分別為 67.86 ± 0.59、 89.63 ± 4.42； 癌旁正常組織、 肝癌組織的 MAP2K3 表達量分別為 5853.61 ± 271.85、 1396.78 ±97.36； 組間數(shù)據(jù)比較差異有統(tǒng)計學意義 （P ＜0.05）。 見圖 1。

圖1 肝癌組織與癌旁正常組織miR－21 及MAP2K3 表達水平比較

2.2 miR－21 對肝癌HepG2 細胞株增殖的影響抑制組增殖細胞數(shù)為 265.73 ± 58.62， 低于增強組的 429.54± 69.35 （P ＜0.05）； 抑制組的遷移細胞數(shù)為 87.52 ± 19.31。 見圖 2。

圖2 miR－21 對肝癌HepG2 細胞株增殖、 遷移、 侵襲的影響

3 討論

我國受公共衛(wèi)生水平限制， 丙型肝炎病毒 （HCV） 和乙型肝炎病毒 （HBV） 感染風險顯著高于西方國家。 長期 HBV 感染極易導致肝硬化， 進而顯著提升肝癌發(fā)病風險。 研究［4-5］表明， 肝炎合并肝硬化和HBV 感染為肝癌發(fā)病的獨立危險因素。既往肝癌診斷多采用甲胎蛋白 （AFP） 作為特異性標志物， 但在臨床診斷中發(fā)現(xiàn)異常凝血酶原 （DCP） 和甲胎蛋白異質體（AFP-L3） 特異度和靈敏度均較差， 故而在肝癌發(fā)生發(fā)展中尋找更具特異度和靈敏度的血清標志物意義重大。

Lin-4 最早被發(fā)現(xiàn)于1993 年， 為最早被發(fā)現(xiàn)的microRNA，在隨后的不斷深入研究中發(fā)現(xiàn)miRNAs 的表達非常保守， 且僅在特定組織、 特定發(fā)育階段表達， 故被譽為基因表達研究領域中的新里程碑。 迄今已有上百種miRNAs 被發(fā)現(xiàn)， 且已有部分miRNAs 被證實在癌細胞的增殖、 遷移、 侵襲中具有獨特的調(diào)控作用， 其中miR-21 在胰腺癌、 食管癌、 肺癌中呈異常表達。Zhuang 等［6］發(fā)現(xiàn)在肝癌患者血清中 miR-21 呈異常水平表達，且結果顯示AFP 和miRNA 組合的敏感性為87.0%， 這預示著miR-21 可作為肝癌診斷的高特異性血清標志物。 本實驗結果顯示， 肝癌組織miR-21 表達水平明顯高于癌旁正常組織 （P ＜0.05）， 表明與正常組織相比， 原發(fā)性肝癌患者癌癥組織中存在明顯的miR-21 過表達現(xiàn)象。

既往實驗多針對肝癌患者miR-21 是否過表達展開討論，而miR-21 對肝癌細胞有關的生物學行為卻鮮有報道。 在細胞增殖、 分化過程中MAPK 蛋白家族中的p38 信號途徑尤為重要， 而MAP2K3 又與p38MAPK 信號通路激活存在密不可分的關系。 本實驗分別轉染了Has-miR-21 inhibitor 和Hsa-miR-21 mimics， 結果顯示抑制組增殖細胞數(shù)為 265.73 ± 58.62， 顯著低于增強組的 429.54 ± 69.35 （P ＜0.05）， 表明 miR-21 對肝癌細胞的生物學行為存在調(diào)控作用。 分析原因在于： 在肝癌HepG2細胞株中存在miR-21 可直接作用的靶點位 MAP2K33＇UTR，miR-21 可通過與 MAP2K33＇UTR 上僅8 bp 的預測位點抑制熒光素酶的表達。 此外本實驗結果也顯示， 肝癌組織中MAP2K3的表達水平明顯低于癌旁正常組織 （P ＜0.05）， 表明作為在原發(fā)性肝癌中呈低表達的MAP2K3 基因可被視為新的抑癌基因，而通過調(diào)控miR-21 的表達對MAP2K3 存在的負向調(diào)節(jié)機制為臨床肝癌治療提供了新思路。

綜上所述， 在原發(fā)性肝癌組織中miR-21 呈過表達， 可通過抑制miR-21 表達， 進而靶向調(diào)節(jié)MAP2K3 表達水平， 從而降低肝癌細胞的增殖、 遷移和侵襲。