一例小型肉雞傳染性腺胃炎的實驗室診斷

摘 ?要：山東東阿某養殖場25日齡小型肉雞，出現生長遲緩、糞便過料、病雞消瘦、死淘率增加等情況。通過病雞剖檢和病原學核酸檢測，結果表明該雞場存在雞傳染性貧血病毒（Chicken anemia virus，CAV）和圓圈病毒3型（Gyrovirus 3，GyV3）的混合感染。經采取綜合防控措施后，本次疫情得到控制。

關鍵詞：雞;傳染性貧血病毒;圓圈病毒3型;混合感染

雞傳染性貧血是由傳染性貧血病毒（Chicken anemia virus，CAV）感染雞而引起，CAV最早于1979年在日本受污染的疫苗中被發現[1]，目前在全世界范圍廣泛傳播[2-5]。14～27日齡小雞的患病率最高，其臨床多表現為貧血、全身淋巴組織萎縮和免疫機能損害，易出現其他病原的并發或繼發感染，尤其是當出現多種免疫抑制病共同感染時，會互相增強致病力，在免疫抑制上出現明顯的協同效應[6]。此外，近年來在雞體上分離到了一種與CAV基因結構相似的病毒，被命名為圓圈病毒屬3型（Gyrovirus 3，GyV3）[7]，GyV3是一種環狀單鏈DNA病毒，2012年在智利患急性腸胃炎的兒童的糞便中首次被發現[8]，2014年該病毒又從雪貂糞便中被檢出[9]。2018年袁世玉等首次從患有傳染性腺胃炎的商品肉雞組織中利用高通量測序的方法檢測到GyV3，并且通過基因序列分析確定該病毒屬于細環病毒科圓圈病毒屬gyrovirus的A分支[10]。該病毒可感染不同品種的蛋雞和肉雞，流行較廣，主要引起免疫抑制、貧血以及腺胃腫大等癥狀，感染雞群發病率一般為 7%～28%，給養禽業帶來較大危害[11]。本實驗室從山東東阿某雜交肉雞養殖場發病雞群中檢測到CAV和GyV3顯示該雞場存在這兩種病毒的雙重感染。現將診療情況報告如下：

1 ?發病情況及臨床癥狀

山東東阿某養殖場25日齡小型雜交肉雞，出現精神沉郁、雞冠蒼白、生長遲緩、糞便稀薄、含有未消化飼料等情況，病雞極度消瘦，病死率10%左右，將發病雞送本實驗室進行病原學檢測。

2 ?剖檢病變

發病雞剖檢可見腺胃腫脹呈球形，腺胃乳頭腫脹甚至消失，脾臟、法氏囊、胸腺明顯萎縮，見圖1。

3 ?實驗室診斷

3.1 ?材料與方法

3.1.1 ?檢測所用試劑及儀器 ?BioSpin膠回收試劑盒、BioSpin組織細胞DNA/RNA共提取試劑盒均購自杭州博日科技有限公司; StarPrep Plasmid Miniprep Kit、2×Taq PCR StarMix with Loading Dye均購自北京康潤誠業生物科技有限公司;DL2000 DNA Marker購自TakaRa公司;凝膠成像系統購自濟南東岱科學器材有限公司;普通PCR儀、離心機購自Thermo公司;電泳儀購自北京市六一儀器廠。

3.1.2 ?引物設計 ?CAV的引物參考從NCBI的GenBank數據庫中下載已有的序列，通過Megalign進行序列比對后，根據保守區域的序列進行引物設計，最后選取CAV F/R和GyV-1s/a[12]兩對引物用于檢測CAV和雞GyV3，引物序列如下：

CAV F： 5' GGACCATCAACGGTGTTCAG 3'

CAV R： 5' CCTCAAGTCCGGCACATTCT 3'，擴增片段為200 bp;

GyV-1s： 5' TGGTCGTGCGTGGAAAC 3'

GyV-1a： 5' GGTATGAATACGAGCCCTTG 3'，擴增片段為336 bp。

3.1.3 ?病毒檢測 ?取病雞組織按1∶5加入pH 7.2的磷酸緩沖鹽溶液（PBS） 混合研磨，反復凍融3～5次，12，000 r/min離心10 min;取上清液200 μL用BioSpin組織細胞DNA/RNA共提取試劑盒提取病毒核酸，利用PCR方法進行CAV，GyV3及其他雞常見病毒的檢測。按如下反應體系和循環參數進行：總體積為20 μL的反應體系，包含2×Taq PCR StarMix 10 μL、10 μM 上下游引物0.5 μL、模板DNA 2.0 μL、dd H2O補充至20 μL。

循環參數：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共30個循環;72 ℃延伸10 min。擴增產物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，最后在凝膠成像系統中觀察、拍照及記錄結果。

3.2 ?結果

3.2.1 ?CAV的PCR檢測結果 ?利用3.1.2病毒檢測中的CAV的檢測引物，按照上述反應體系及循環參數進行PCR檢測，結果4份組織均擴增出200 bp左右的條帶，與預期的目的條帶大小相符，見圖2。

3.2.2 ?雞GyV3的PCR檢測結果 ?利用3.1.2病毒檢測中的GyV3的檢測引物，按照上述反應體系及循環參數進行PCR檢測，結果4份組織均擴增出336 bp左右的條帶，與預期的目的條帶大小相符，見圖3。

3.2.3 ?雞常見病毒的PCR檢測結果 ?雞的其他常見病毒，包括禽流感病毒（AIV）、新城疫病毒（NDV）、傳染性支氣管炎病毒（IBV）、腺病毒（FADV）、傳染性法氏囊炎病毒（IBDV）、網狀內皮增生癥病毒（REV）、白血病病毒（ALV）和馬立克氏病毒（MDV）PCR檢測結果均為陰性，見圖4。

結合雞群發病情況、剖檢病變及實驗室檢測結果，確診該病例為CAV與雞GyV3的混合感染。

4 ?防治措施

雞CAV和GyV3都屬于免疫抑制性病原，一旦感染會使雞體的抵抗力下降，容易引發其他疾病的混合感染。因此對此類疾病的預防與診斷十分重要。平時應提高雞舍的飼養管理水平，要保證雞群日糧中含有豐富的氨基酸、微量元素和維生素，提高機體免疫力[13]。在日常管理過程中，定期對雞舍、周圍環境以及用具等進行消毒。對雞群定期進行檢疫，及時淘汰發病雞，通過疫苗接種提高雞群特異性抵抗力。

5 ?討論

雞傳染性腺胃炎是一種在家禽養殖生產中較為常見的一類疫病，以雞群生長不良、消瘦、大小不均、糞便過料等癥狀為特征，剖檢病變可見腺胃腫大，胸腺、法氏囊、脾臟等免疫器官萎縮，該病可發生于不同品種的蛋雞和肉雞，常見于雛雞和青年雞。由于該病能嚴重影響家禽的生產性能，給養殖業造成了較大危害。根據之前的報道，傳染性法氏囊炎病毒、傳染性支氣管炎病毒、腺胃壞死病毒、禽白血病病毒、網狀內皮增生癥病毒、呼腸孤病毒等均可能與傳染性腺胃炎有關[14-19]。目前，多數學者都認為，傳染性腺胃炎是一種病因較為復雜的疾病，除病毒以外，細菌、霉菌毒素等可能都是誘發腺胃炎的重要因素。

本次實驗室檢測根據臨床發病癥狀及病理剖檢特征，對該病雞場所送病料進行CAV和雞GyV3的檢測，實驗結果顯示該雞場存在這兩類病毒的雙重感染。CAV作為一種免疫抑制性病毒會侵害家禽的免疫系統，導致機體更容易出現其他病原的并發或繼發感染，尤其是當出現多種免疫抑制病共同感染時，會互相增強致病力，在免疫抑制上出現明顯的協同效應[6]。近年來，CAV在雞群內蔓延嚴重，一旦發病，立即隔離病雞，清理雞舍中的污染物和排泄物，對雞舍進行帶雞消毒，對可能受威脅雞群通過免疫弱毒凍干苗進行預防。特別要注意的是CAV很容易污染疫苗，有研究表明，CAV感染會顯著降低禽流感滅活疫苗和活疫苗的免疫效果，對活疫苗的免疫效果影響更大，CAV感染會降低馬立克氏病的疫苗免疫功能[20-22]。因此一定要加強疫苗的監管，避免人為造成雞傳染性貧血病的傳播。

GyV3最早是從患有胃腸炎兒童和腹瀉患者糞便中檢測到[8，23]，2018年Li等首次從患有腺胃炎的病雞腺胃中鑒定出GyV3[11]。袁世玉等[7]對336份腺胃炎病例進行流行病學調查，其中陽性病例為42例，占比12.5%，說明GyV3與腺胃炎具有一定的相關性。刁治君等[24]報道了CAV和GyV3共同感染導致的肉雞腺胃炎病例，病雞表現消化不良、糞便過料、均勻度差等癥狀，與本文病例情況基本一致。對于GyV3來說，因為是近年才在雞群中發現，目前還沒有特異性的疫苗來預防，應以加強飼養管理和提高雞體抵抗力等措施為注意防控措施。

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