三孢布拉氏霉菌發酵產番茄紅素工藝條件的優化

劉春芬 慕金超

摘要：利用三孢布拉氏霉菌發酵生產番茄紅素，并對其發酵條件進行探討，確定其最佳發酵條件。結果表明，番茄紅素最大吸收波長為508 nm;活化的凍干粉菌種在斜面培養基上于25 ℃培養5 d后，呈較好生長狀態，菌絲粗壯，孢子生長狀態飽滿，鏡檢顯示，其個體生長狀態良好;擴大培養120 h時孢子數量達到最高峰;發酵至36 h時添加阻斷劑效果最好，發酵至72 h時添加增氧劑效果最好。通過發酵條件優化的正交試驗發現，三孢布拉氏霉菌發酵產番茄紅素的最優發酵工藝為發酵溫度25 ℃、pH值5.0、發酵時間5 d、接種量10.0%。

關鍵詞：番茄紅素;三孢布拉氏霉菌;發酵;工藝條件

中圖分類號： TQ920.6;S182? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0214-04

番茄紅素主要存在于植物細胞的有色體中，因具有抗癌、降低心血管疾病發病率、預防動脈粥樣硬化、提高免疫力等生理功能，國內外對其研究熱度逐年遞增，目前國內外生產番茄紅素的方法有以下幾種：有機溶劑提取法、超臨界萃取法、化學合成法等，利用這些方法合成的番茄紅素存在化學物殘留問題，品質不高。采用生物合成中的微生物合成法，利用三孢布拉氏霉菌發酵產出番茄紅素，和其他的方法相比，具有不受季節控制、操作工藝簡單、用時短、生產成本較為低廉等優勢。另外相對其他幾種方法來說，生物合成法可以獲得較高的番茄紅素得率，是生產番茄紅素的一種理想途徑。

本試驗研究利用生物發酵法生產番茄紅素時發酵條件、培養基成分、各類抑制劑等對成品產量及品質的影響，并對工藝進行優化，初步建立通過微生物發酵生物合成番茄紅素的基本工藝。

1 試驗材料

1.1 試驗時間及地點

試驗于2019年6—10月進行，試驗地點為學院微生物實訓中心。

1.2 材料及試劑

GM3.560三孢布拉氏霉（中國微生物菌種保藏中心，編號：ATCC 14059）;玉米粉、玉米淀粉（在超市或農貿市場購買）;番茄紅素標準品（CAS：502-65-8，有效成分含量>98%，規格：20 mg/支）;可溶性淀粉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、淀粉均為分析純;瓊脂、維生素B1、酵母膏為生化試劑。

1.3 培養基

活化用培養基：磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂 0.5 g、可溶性淀粉15 g、酵母膏4.0 g，溶于 1 000 mL 蒸餾水中，加入瓊脂15 g，充分溶解。121 ℃ 滅菌20 min，制備斜面。

擴大培養用培養基：除不添加瓊脂外，其他成分同活化用培養基。

發酵培養基：玉米粉40 g、淀粉糖化液40 g、可溶性淀粉50 g、磷酸二氫鉀0.5 g、七水硫酸鎂 0.25 g、維生素B1少量，溶于1 L蒸餾水中，加熱至完全溶解，調節pH值為6.5，分裝在10個錐形瓶中標號1～10，冷卻備用。

2 試驗方法

ATCC 14059→活化→擴大培養→計孢子數→接種至發酵培養基中→發酵→添加阻斷劑和增氧劑→發酵條件的優化→發酵醪→過濾→濾液→減壓濃縮→成品

2.1 番茄紅素最大吸收波長的確定

對番茄紅素標準品在480～520 nm范圍內進行最大吸收波長的掃描[1-3]，找到番茄紅素標準品最大吸收峰，由此確定番茄紅素的最大吸收波長。

2.2 番茄紅素標準線性范圍的確定

取20 mg番茄紅素標準品置于50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，將其作為儲備液。用移液管移取1 mL儲備液置于50 mL容量瓶中，同樣用乙酸乙酯定容至刻度，作為標準使用液。分別吸取標準使用液0.00、2.50、5.00、7.50、10.00、12.50 mL 置于 25 mL 容量瓶中，并用乙酸乙酯定容至刻度，然后于最大吸收波長處分別測定其吸光度，繪制標準曲線。

2.3 菌種的活化及擴大培養

將0.1 mL無菌生理鹽水加入到凍干菌粉的安瓿瓶中，振蕩成懸浮狀，吸取全部菌體懸浮液，移至4支斜面培養基上，在25 ℃培養5～7 d[4-7]。將活化后的菌種接種到擴大培養用培養基中，在25 ℃振蕩培養，轉速為150 r/min。自培養48 h開始每隔24 h取菌液計數，當培養基中孢子數達109～1010個/mL 時，停止培養，此培養液備用。

2.4 發酵培養

向發酵培養基中接種10%種子液，搖勻，在 25 ℃ 振蕩培養，轉速為150 r/min[8]。

2.5 阻斷劑及增氧劑添加時間的確定

選用煙草廢棄物作為阻斷劑，在發酵培養24、30、36、42、48 h時分別向1～5號瓶中加入阻斷劑007 g，均進行5 d發酵培養。過濾發酵液，棄去濾渣，將濾液減壓濃縮，分析確定阻斷劑添加時間。以不添加阻斷劑為空白對照。

分別在發酵培養的48、60、72、84、96 h時向6～10號瓶中各加入增氧劑30% H2O2 0.5 g，均進行 5 d 發酵培養，分析確定增氧劑最佳添加時間。以不添加增氧劑為空白對照。

2.6 發酵條件的優化

探討溫度（20、25、30 ℃）、pH值（4.5、5.0、55）、發酵時間（4、5、6 d）、接種量（7.5%、10.0%、125%）等因素[9-14]對發酵結果的影響，分析確定采用三孢布拉氏霉菌發酵生產番茄紅素的最佳條件。

3 結果與分析

3.1 番茄紅素最大吸收波長的確定

如圖1所示，番茄紅素標準品在508 nm處有最大吸收峰，因此番茄紅素的最大吸收波長為508 nm。

3.2 番茄紅素標準工作曲線的繪制

采用分光光度計在波長為508 nm處測定標準系列溶液的吸光度，得到如圖2所示結果。

3.3 菌種的活化培養

在斜面培養基上于25 ℃培養5 d后的凍干粉菌種呈較好的生長狀態，菌絲粗壯，孢子生長狀態飽滿。圖3顯示，該菌菌絲非常粗壯且長度較大，菌絲無橫膈膜，屬于單細胞，具有多個細胞核，未發現假根。

3.4 種子的擴大培養時間

從表1可以看出，從培養48 h開始，隨著培養時間的延長，孢子數呈對數遞增趨勢，到培養120 h時，孢子數量達到最高峰，隨后再延長培養時間，孢子數量沒有明顯的增加，說明此時擴大培養基中營養成分已經較少，代謝產物積累較多，菌體開始由對數生長期轉向穩定生長期，新生細胞數與死亡細胞數保持動態平衡，孢子數量出現減少趨勢，可以推論，此后霉菌將進入衰亡期，因此，選擇在培養120 h時終止培養，得到種子培養液。

3.5 阻斷劑添加時間的確定

在508 nm處分別測定減壓濃縮后濾液的吸光度[15]，由于測得的吸光度過大，不在番茄紅素標準工作曲線的線性范圍內，因此測定之前分別將5瓶發酵液稀釋2倍，得到圖4所示結果。空白對照組發酵5 d后，經測定吸光度為0.295。由圖4可見，比較試驗組的吸光度與對照組發現，發酵過程中添加阻斷劑能有效阻斷胡蘿卜素的生成，從而使得產物仍為番茄紅素。當發酵進行至36 h時添加阻斷劑效果最好，因此，選擇添加時間為發酵 36 h 時。

3.6 增氧劑添加時間的確定

在508 nm處分別測定減壓濃縮后濾液的吸光度，由于測得吸光度過大，不在番茄紅素標準工作曲線的線性范圍內，因此測定之前分別將5瓶發酵液稀釋2倍，得到圖5所示結果。空白對照組發酵5 d后，經測定吸光度值為0.287。由圖5可見，比較試驗組的吸光度與對照組發現，發酵過程中添加增氧劑能有效增加番茄紅素的生成量。當發酵進行至72 h時添加增氧劑效果最好，因此，選擇添加時間為發酵72 h時。

3.7 發酵條件的優化

3.7.1 發酵溫度的確定 由圖6可知，在一定范圍內當發酵溫度升高時，番茄紅素的濃度也隨之增加;當溫度上升到25 ℃時，番茄紅素的濃度達到最高值;如果溫度繼續升高，番茄紅素的濃度反而下降，這是因為三孢布拉氏霉菌的最適發酵溫度為 25～28 ℃，因此選擇25 ℃為其發酵最佳溫度。

3.7.2 發酵液pH值的確定 由圖7可知，當發酵液pH值上升至5時，番茄紅素的濃度達到最高值;繼續升高pH值，番茄紅素的濃度反而下降，說明三孢布拉氏霉菌的最適發酵pH值在5左右。

3.7.3 發酵時間的確定 由圖8可知，當發酵進行至5 d時，番茄紅素含量達到最大值，其后，隨著時間的延長，產物含量不增反降，可能是由于番茄紅素本身不穩定，發生了部分分解，因此，選擇最佳發酵時間為5 d。

3.7.4 接種量的確定 由圖9可知，在一定范圍內番茄紅素產量隨著接種量增加逐漸遞增，當接種量增加到10%時，番茄紅素產量達到最大，其后隨著接種量的持續增加，番茄紅素產量沒有明顯變化，從經濟角度考慮，選擇接種量為10%。

3.7.5 發酵條件優化的正交試驗結果 由于測得吸光度不在番茄紅素標準工作曲線的線性范圍內，因此測定之前分別稀釋2倍，得到表2所示結果。由正交試驗結果可知，影響三孢布拉氏霉菌發酵產番茄紅素各因素的主次順序是C>A>B>D，即發酵時間>發酵溫度>pH值>接種量。由k值可得，最佳組合方案為A2B2C2D2，即發酵溫度25 ℃、培養基pH值5.0、發酵時間5 d、接種量10.0%。

因為最佳組合方案沒有在9組正交試驗中出現，所以根據正交試驗所得到的最佳條件因素做驗證試驗。經過試驗測定得出，在最佳組合方案下吸光度為1.121，對照標準曲線計算得到的番茄紅素濃度為 17.61 μg/mL，比正交試驗4號的 15.93 μg/mL 大。結果表明，發酵溫度25 ℃、培養基pH值5.0、發酵時間5 d、接種量10.0%是發酵最佳工藝參數。

4 結論

本試驗確定了番茄紅素的最大吸收波長為 508 nm;活化的凍干粉菌種在斜面培養基上于25 ℃培養5 d后，呈較好的生長狀態，菌絲粗壯，孢子生長狀態飽滿，鏡檢顯示，其個體生長狀態良好;擴大培養120 h時孢子數量達到最高峰;當發酵進行至36 h時添加阻斷劑效果最好，發酵進行至 72 h 時添加增氧劑效果最好;通過發酵條件優化的正交試驗發現，三孢布拉氏霉菌發酵產番茄紅素的最佳發酵條件為發酵溫度25 ℃、培養基pH值5.0、發酵時間5 d、接種量10.0%。

參考文獻：

[1]吳 燦，夏延斌，唐 鑫. 響應面法優化蓮子黃酒的發酵工藝條件[J]. 現代食品科技，2013，29（7）：1675-1679.

[2]吳軍林，吳清平，張菊梅，等. 番茄紅素的微生物合成及發酵生產研究進展[J]. 食品科學，2013，34（19）：336-340.

[3]王 敏，楊 慧，高俊蓮，等. 高產番茄紅素鏈霉菌選育及搖瓶發酵研究[J]. 中國生物工程雜志，2009，29（12）：64-68.

[4]馬永強，韓春然. 三孢布拉霉生產番茄紅素發酵條件的研究[J]. 食品研究與開發，2007，28（4）：54-57.

[5]萬紅貴，吳啟賜，蔡 恒，等. 基于三孢布拉霉菌番茄紅素的提取工藝研究進展[J]. 安徽農業科學，2010，38（10）：5315-5317，5424.

[6]黃 進，高偉欣，喬漢楨，等. 從新鮮番茄中提取番茄紅素的條件優化[J]. 飼料研究，2019，42（9）：86-90.

[7]陳文靜，張 歡，董 旭，等. 番茄紅素的研究現狀及應用前景[J]. 安徽農業科學，2015，43（27）：29-32，99.

[8]巴寧寧，王 瑞，王英明，等. 提取方法不同對番茄紅素油樹脂抗氧化活性的影響[J]. 糧食與油脂，2019，32（8）：83-86.

[9]張玉丹，楊 陽，劉沐霖. 番茄紅素生產工藝研究進展[J]. 中國食物與營養，2016，22（4）：38-41.

[10]蔡文杰，湯華成，溫丹旭. 阻斷劑對三孢布拉霉菌產番茄紅素的影響[J]. 黑龍江八一農墾大學學報，2017，29（3）：45-48，69.

[11]龐昆云，吳嘉琦，王澤建，等. 三孢布拉霉菌發酵番茄紅素提取工藝的優化[J]. 華東理工大學學報（自然科學版），2016，42（3）：343-350.

[12]姜 豐，王 穎，湯華成，等. 三孢布拉霉菌發酵生產番茄紅素的最佳條件的篩選[J]. 黑龍江八一農墾大學學報，2013，25（2）：48-52.

[13]范 超，洪 皓，李 妍，等. 三孢布拉霉發酵生產類胡蘿卜素的產業化關鍵點探討[J]. 食品與發酵工業，2018，44（5）：284-290.

[14]閆 興，向夢雄，王常高，等. 代謝調節劑對三孢布拉氏霉菌發酵的影響[J]. 湖北工業大學學報，2016，31（1）：85-88.

[15]向夢雄，閆 興，王常高，等. 發酵促進劑對三孢布拉氏霉菌發酵產β-胡蘿卜素的影響[J]. 氨基酸和生物資源，2015，37（1）：56-60.肖亞冬，楊慧珍，李大婧，等. 不同護色預處理對鐵棍山藥熱風干燥特性及品質變化的影響[J]. 江蘇農業科學，2020，48（20）：218-223.