苦菜、茵陳內生真菌的分離鑒定與生物活性

王盈桐 李學威 陸云彪

摘要：植物內生菌是尚未得到充分開發利用的微生物資源。為了充分開發苦菜、茵陳這2種菊科植物的內生菌資源，獲得具有抗菌、抗氧化活性的內生菌，采用組織分離法從茵陳、苦菜中分離內生真菌，并使用平板對峙法對內生真菌進行抗菌活性驗證，并測定內生真菌提取物1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除率，以驗證內生真菌的抗氧化活性。此外，對于具有抗菌和抗氧化活性的菌株，通過內轉錄間隔區（ITS）測序并構建系統發育樹、形態學觀察進行鑒定。結果表明，分離自苦菜的KC-G-2-3-2和分離自茵陳的YC-J-4-2對串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌均具有拮抗作用，抑菌率在50%以上，其中KC-G-2-3-2對白絹病病菌也有較強的抑制作用;2株內生真菌菌液和菌體提取物都表現出較好的DPPH·清除功效，其中YC-J-4-2的PDB培養基發酵液的菌液提取物對DPPH·的清除率超過90%。由菌株鑒定結果看出，KC-G-2-3-2為木霉屬菌株，YC-J-4-2為間座殼屬菌株。

關鍵詞：苦菜;茵陳;內生真菌;抗菌活性;抗氧化活性

中圖分類號：S182?? 文獻標志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0265-05

內生菌（endophytes）是一類非常重要的微生物資源，在自然界中廣泛存在，它們具有獨特的生理和代謝機制，能夠適應植物內部特殊的環境，同時還能夠產生多種活性物質，幫助植物抵抗病原微生物[1-2]。此外，一些藥用植物內生菌因長時間與宿主協同進化，可產生某些與宿主植物相似或相同的具有藥用價值的代謝物質[3-6]。因此，從植物內生菌中，特別是藥用植物內生菌中挖掘活性天然產物，不僅可為藥物的研發提供新的方向，還能在一定程度上解決傳統的天然產物藥源——藥用植物生長緩慢、資源緊缺等問題。

苦菜（Sonchus oleraceus）和茵陳（Artemisiae scopariae）廣泛分布于全國各地，是藥食兩用的菊科植物。近年來，學者們對這2種植物的活性成分研究也較為深入，已經證實它們均具有抗菌、抗氧化活性[7-8]。苦菜中的抗氧化活性成分主要包括黃酮[9-10]、多酚[11]和多糖[12]，其提取物對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌和霉菌都具有較好的抑制作用[13-14]。茵陳的抗氧化活性成分主要為香豆素類化合物[15]、黃酮類化合物[16-17]、綠原酸[18]及揮發油類化合物[19]，其中綠原酸對多種細菌、霉菌具有抑制作用[20]。目前，針對苦菜、茵陳植物內生菌的研究鮮有報道，本研究從苦菜、茵陳中分離獲得內生真菌，測定其抗菌、抗氧化活性，并對有活性的菌株進行鑒定，旨在為進一步開發利用植物內生菌資源提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 新鮮、健康的茵陳和苦菜于2018年10月初采集自山東泰山。

1.1.2 供試菌株 供試菌株有串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、白絹病病菌（Selerotium rolfsii）、層生鐮刀菌（Fusarium proliferatum）等植物病原真菌，由山東農業大學農業微生物重點實驗室惠贈。

1.1.3 培養基 內生菌分離純化培養基包括馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基和麥芽汁（ME）培養基。PDA配方：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，瓊脂 20 g，1 L去離子水，pH值自然。ME配方：20 g麥芽提取物，2 g蔗糖，0.2 g蛋白胨，20 g瓊脂，1 L去離子水，pH值自然。內生菌發酵培養基為馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養基和ME液體培養基，即分離純化培養基中不加瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 內生菌的分離純化 采用組織分離法[21]分離純化苦菜和茵陳中的內生菌。將新鮮植物材料用無菌水沖洗干凈并晾干，將根、莖、葉分別用無菌手術刀片切成小塊，先用75%乙醇消毒3 min、無菌水沖洗3次，再用10%次氯酸鈉浸泡8 min、無菌水沖洗3次，最后用無菌濾紙吸干水分。將組織材料縱切后置于分離純化培養基上，每個培養基放4組，于28 ℃恒溫培養箱中培養7 d，待組織塊邊緣有菌絲長出后，挑取不同形態的菌絲接種于新鮮培養基上，反復分離純化即得內生真菌。

1.2.2 抑菌試驗 采用平板對峙法[22]進行抑菌試驗，用直徑為5 mm的無菌打孔器打取供試病原真菌菌餅、內生菌菌餅，將其對稱放于PDA培養基上，于28 ℃下培養5 d，分別測量病原菌對峙側、非對峙側半徑，并按如下公式計算抑菌率：

抑菌率=（非對峙側半徑-對峙側半徑）/（非對峙側半徑）×100%。

挑取供試病原真菌和內生菌生長交界處的菌絲制片，并用顯微鏡觀察其形態。

1.2.3 發酵液的制備和萃取 挑取內生菌菌絲接種于裝有100 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、150 r/min條件下培養10 d。將發酵培養物過濾，除去菌體，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，于55 ℃條件下減壓濃縮蒸干，即得菌液粗提物。將過濾得到的菌體用適量95%乙醇冷凝回流3次，合并乙醇相，減壓濃縮蒸干，即得菌體粗提物。用體積比為1 ∶ 1的無水乙醇和去離子水溶液溶解粗提物。菌液粗提物和菌體粗提物均置于4 ℃冰箱保存備用。

1.2.4 內生菌1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）清除能力測定 參照Li等的方法[23]測定內生菌清除DPPH·的能力。精確稱取0.001 97 g DPPH粉末，用無水乙醇溶解并定容至100 mL（終濃度為0.05 mmol/L），作為母液，于4 ℃下低溫避光保存。向2 mL DPPH母液中加入1 mL菌液粗提物和2 mL無水乙醇（最終提取液濃度為 3 mg/mL），混勻，于25 ℃下水浴30 min，以相同濃度的維生素C溶液為陽性對照，測定517 nm處的吸光度，記作A1處理;另外將1 mL菌體粗提物與 4 mL 無水乙醇混勻，記作A2處理。按如下公式計算DPPH自由基清除率：

DPPH自由基清除率=[1-（D517 nm（1）-D517 nm（2））/D517 nm（3）]×100%。

式中：D517nm（1）為提取液或維生素C溶液的吸光度;D517nm（2）為背景溶液（提取液或維生素C溶液）不加DPPH時的吸光度;D517 nm（3）為空白對照（蒸餾水代替提取液或維生素C溶液）的吸光度。每個樣品設3次重復，取平均值。

1.2.5 菌株的鑒定 采用平板培養法、顯微鏡鏡檢法對具有活性的內生真菌進行形態學鑒定。通過內轉錄間隔區（ITS）測序對菌株進行分子生物學鑒定。將平皿中培養好的內生真菌直接交給睿博興科（青島）測序部進行PCR測序。將測定的ITS序列與GenBank中已知的核酸序列進行BLAST比對分析，從中獲得與菌株ITS同源的序列，用MEGA 70軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 內生菌對病原真菌的拮抗作用

從苦菜中共分離獲得21株內生真菌，其中從根部、莖部分別分離獲得14、7株;從茵陳中共分離獲得13株內生真菌，其中從根部、莖部分別分離獲得8、5株。使用平板對峙法測定內生真菌對病原真菌的拮抗能力，結果顯示，分離自苦菜根部的 KC-G-2-3-2對白絹病病菌、串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌等4種植物病原菌都具有良好的抑菌效果，抑菌率分別為50%、40%、41%、65%（圖1）;分離自茵陳莖部的YC-J-4-2對串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌等3種植物病原菌具有良好的抑菌效果，抑菌率分別為56%、46%、63%，但對白絹病菌無抑菌作用（圖2）。

由圖1、圖2還可以看出，在內生菌菌株 KC-G-2-3-2、YC-J-4-2的作用下，4種植物病原真菌菌絲的正常生長均受到了抑制，表現為無法向外生長延伸，被抑制的地方產生明顯的分界線，對該位置的菌絲進行顯微觀察，未發現病原真菌菌絲有畸形現象，表明內生真菌主要是通過與病原真菌競爭生存空間和營養物質來抑制其生長。

2.2 待測樣品的制備

將“2.1”節中得到的具有抑菌活性的內生菌分別用PDB培養基、ME液體培養基進行搖瓶培養，10 d 后共得到4份待測樣品， 將KC-G-2-3-2

的PDB發酵液記作A樣品，ME發酵液記作B樣品;YC-J-4-2的PDB發酵液記作C樣品，ME發酵液記作D樣品。4份樣品過濾后，分別萃取過濾液和菌體，將其進一步分為菌液提取物、菌體提取物，共8份樣品，每份樣品的質量見表1。

2.3 抗氧化活性的測定結果

由表2可知，在3 mg/mL的質量濃度下，測試樣品對DPPH·表現出了不同程度的清除作用，其中YC-J-4-2的PDB培養基發酵液的菌液粗提物對DPPH·的清除率超過了90.0%，菌體粗提物對DPPH·的清除率超過了80.0%，顯示出較強的抗氧化活性，其余樣品對DPPH·的清除率均在500%以上。

2.4 內生菌的鑒定結果

2.4.1 形態學鑒定結果 KC-G-2-3-2菌株的菌落形態和鏡檢結果見圖3。KC-G-2-3-2菌株生長迅速，初期菌落為白色，呈致密、絨毛狀，隨后菌落中央產生綠色孢子，中央變成綠色。分生孢子產生后，單生或簇生，呈圓形、綠色，初步鑒定屬于木霉屬（Trichoderma sp.）。

YC-J-4-2菌株的菌落形態和鏡檢結果見圖4。YC-J-4-2菌株在生長初期呈乳白色，氣生菌絲發達致密，呈羽毛狀，后期逐漸轉為灰色。在顯微鏡下只觀察到菌絲，未見有分生孢子產生，可能與培養時間、培養條件有關，需要進一步用分子手段對其進行鑒定。

2.4.2 分子水平的鑒定結果 經測序可知，KC-G-2-3-2菌株ITS 序列長581 bp（GenBank登錄號：MN823637）。對該序列進行BLAST比對分析，結果顯示，它與短木霉（Trichoderma breve）的同源性最高，相似度為100%;選出相關性較高的屬內相關菌株的ITS序列，用MEGA 7.0構建系統發育樹，結果顯示，它與Trichoderma breve聚為1族（圖5），確定KC-G-2-3-2為木霉屬菌株，命名為Trichoderma breve KC-G-2-3-2。

經測序可知，YC-J-4-2菌株ITS序列長 544 bp（GenBank登錄號：MN823638）。對該序列進行BLAST比對分析，結果發現，它與間座殼菌（Diaporthe goulteri）的同源性最高，相似度為100%;選出相關性較高的屬內相關菌株的ITS序列，用MEGA 7.0構建系統發育樹，結果顯示，它與Diaporthe goulteri聚為1族（圖6），確定YC-J-4-2為間座殼屬菌株，命名為Diaporthe goulteri YC-J-4-2。

3 結論與討論

化學農藥的濫用不僅會對人類生態環境產生惡劣影響，還會導致病蟲害抗性等問題，因而亟需開發出高效、低毒、無污染的新型農藥。生物農藥具有選擇性強、藥效高、對環境較友好、不易產生抗藥性等優點，這些特性不僅滿足了當代人的需求，更滿足了可持續發展的戰略目標，因此，生物農藥具有十分廣闊的發展前景，有望成為最具發展潛力的農藥品種[24-25]。本試驗以藥食兩用植物苦菜、茵陳為材料，分離篩選出2株對串珠鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、層生鐮刀菌具有良好抑制作用的植物內生菌KC-G-2-3-2、YC-J-4-2，其中KC-G-2-3-2還對白絹病菌有良好的抑制作用。這2株植物內生真菌均有潛力作為生防菌開發為生物農藥。

抗氧化活性是備受醫學界關注的生物學活性之一。越來越多的研究結果顯示，抗氧化是預防衰老的重要途徑，消除過多的氧化自由基對于預防許多由自由基引起的相關疾病是非常重要的。抗氧化劑對于防治癌癥、心臟病、腦卒中、阿爾茨海默癥、風濕性關節炎及白內障等慢性疾病都具有一定的效果[26]。本試驗分離得到2株植物內生真菌 KC-G-2-3-2、YC-J-4-2，用不同液體培養基發酵后，其發酵過濾液、菌體萃取液的抗氧化活性檢測結果顯示，2株內生菌均具有良好的DPPH·清除能力，清除率均在50%以上。特別是YC-J-4-2的PDB培養基發酵液的菌液提取物，對DPPH·的清除率超過90%，菌體提取物對DPPH·的清除率超過80%，顯示出較強的抗氧化活性。

通過形態學及分子生物學水平的鑒定，確定 KC-G-2-3-2為木霉屬菌株，YC-J-4-2為間座殼屬菌株，這2個屬均為常見的植物內生菌屬，近年來關于這2個菌屬菌株的抗菌、抗氧化研究也較多。如Hu等從荔枝內生菌綠木霉（Trichoderma virens）中分離得到一系列倍半萜類化合物，這些化合物均具有抑制植物病原真菌的活性[27];Ikram等研究發現，牛茄子內生菌婁地青霉（Penicillium roqueforti）、里氏木霉（Trichoderma reesei）的發酵萃取物具有抑制植物病原細菌和抗氧化活性[28];Guo等從植物內生菌間座殼屬某菌株中獲得了1個新化合物diaporone A，該化合物抑芽孢桿菌的活性中等，細胞毒活性弱[29];da Rosa等采用超臨界流體萃取技術從植物內生菌Diaporthe schini中獲得了具有抗氧化活性的提取物，該提取物對DPPH·的清除率可達9662%[30]。本試驗從苦菜、茵陳中所得菌株，既具有拮抗植物病原真菌活性，又具有抗氧化活性，具有較高的潛在應用價值，結果可為這2種植物內生菌的開發利用提供理論基礎和數據支持。

參考文獻：

[1]楊志軍，鄧 毅，曼 瓊，等. 內生菌在天然藥物研究中的研究進展[J]. 中國臨床藥理學雜志，2018，34（5）：593-596.

[2]黃敬瑜，張楚軍，姚瑜龍，等. 植物內生菌生物抗菌活性物質研究進展[J]. 生物工程學報，2017，33（2）：178-186.

[3]陳金陽，陸儒涵，王 玲，等. 藥用植物內生菌抗氧化活性研究進展[J]. 中草藥，2016，47（20）：3720-3727.

[4]鄭有坤，劉 凱，熊子君，等. 藥用植物內生放線菌多樣性及天然活性物質研究進展[J]. 中草藥，2014，45（14）：2089-2099.

[5]靳 錦，趙 慶，張曉梅，等. 植物內生菌活性代謝產物最新研究進展[J]. 微生物學雜志，2018，38（3）：103-113.

[6]Masand M，Jose P A，Menghani E，et al. Continuing hunt for endophytic actinomycetes as a source of novel biologically active metabolites[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2015，31（12）：1863-1875.

[7]劉 暢，嚴銘銘，邵 帥，等. 山苦菜化學成分及藥理作用的研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2015，21（20）：231-234.

[8]劉玉萍，邱小玉，劉 燁，等. 茵陳的藥理作用研究進展[J]. 中草藥，2019，50（9）：2235-2241.

[9]韓陽陽，王天曉，朱海芳，等. 苦菜不同部位提取物的抗氧化活性[J]. 食品科學，2010，31（19）：45-48.

[10]周勸娥，田呈瑞，關 為，等. 陜西苦菜葉總黃酮的提取及抗氧化活性的測定[J]. 食品工業科技，2013，34（9）：97-102.

[11]鄭翠萍，田呈瑞，馬婷婷，等. 苦菜多酚的提取及其抗氧化性研究[J]. 食品與發酵工業，2016，42（3）：224-230.

[12]謝三都，謝雷朋，龔志鵬. 苦菜粗多糖的制備及其抗氧化活性的研究[J]. 農產品加工，2015（6）：15-18，22.

[13]郭愛華，任靜宇，王 佩，等. 苦菜不同部位提取物的抑菌活性與抗氧化性[J]. 貴州農業科學，2016，44（4）：60-62.

[14]侯金麗. 苦菜提取液抗菌效能試驗研究[J]. 現代農業科技，2015（7）：77-81.

[15]祝 茗，張開梅，丁 燕. 茵陳蒿中濱蒿內酯及東莨菪素抗氧化活性的評價[J]. 沈陽藥科大學學報，2016，33（11）：889-893.

[16]齊善厚. 茵陳黃酮的抗氧化及鎮痛作用研究[J]. 現代食品科技，2013，29（3）：501-504.

[17]史 娟，張澤浩，李 江，等. 陜西茵陳黃酮提取及抗氧化性能研究[J]. 油脂化學，2018，43（9）：30-34，39.

[18]康 娜，梁永鋒. 茵陳中綠原酸提取工藝及抗氧化活性研究[J]. 中國中醫藥科技，2017，24（5）：587-590，598.

[19]趙娜娜，路 偉，傅文佳，等. 四種菊科蒿屬植物精油殺螨活性及茵陳蒿揮發油成分分析[J]. 新疆農業科學，2019，56（1）：166-173.

[20]趙良忠，蔣賢育，段林東，等. 茵陳蒿水溶性抗菌物質提取工藝和抑菌效果研究[J]. 食品工業科技，2005，26（10）：100-102.

[21]Li Y L，Xin X M，Chang Z Y，et al. The endophytic fungi of Salvia miltiorrhiza Bge.f.alba are a potential source of natural antioxidants[J]. Botanical Studies，2015，56（5）：1-7.

[22]王貴生，陸 娟，唐 娟，等. 1株亳菊內生菌的分離鑒定及其生物活性分析[J]. 西北農林科技大學學報（自然科學版），

2019，47（4）：138-145，154.

[23]Li X，Li X M，Xu G M，et al. Antioxidant metabolites from marine alga-derived fungus Aspergillus wentii EN-48[J]. Phytochemistry Letters，2014，7（1）：120-123.

[24]郭明程，王曉軍，蒼 濤，等. 我國生物源農藥發展現狀及對策建議[J]. 中國生物防治學報，2019，35（5）：755-758.

[25]Seiber J N，Coats J，Duke S O，et al. Biopesticides：state of the art and future opportunities[J]. Journal of Agricultural Food Chemistry，2014，62（48）：11613-11619.

[26]張 明，馮璐璐. 抗氧化活性評價標準與發展[J]. 安徽農學通報，2010，16（8）：33-34，106.

[27]Hu Z B，Tao Y W，Tao X Y，et al. Sesquiterpenes with phytopathogenic fungi inhibitory activities from fungus Trichoderma virens from Litchi chinensis Sonn.[J]. Journal of Agricultural Food Chemistry，2019，67（38）：10646-10652.

[28]Ikram M M，Ali N，Jan G. et al. Novel antimicrobial and antioxidative activity by endophytic Penicillium roqueforti and Trichoderma reesei isolated from Solanum surattense[J]. Acta Physiol Plant，2019，41（164）：1-11.

[29]Guo L F，Niu S B，Chen S L，et al. Diaporone A，a new antibacterial secondary metabolite from the plant endophytic fungus Diaporthe sp.[J]. Journal of Antibiotic，2019，73：116-119.

[30]da Rosa B V，Kuhn K R，Ugalde G A，et al. Antioxidant compounds extracted from Diaporthe schini using supercritical CO2 plus cosolvent[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2019，43：133-141.任曙霞，郝 玲，李中林，等. 連云港市小麥拔節期凍害災損判別指標和風險分布[J]. 江蘇農業科學，2020，48（20）：270-275.