紫外-可見分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中總三萜及多糖含量

朱莉 徐曉萍 黃婷

摘 要：本文建立了測定破壁靈芝孢子粉中總三萜及多糖含量的紫外-可見分光光度法。總三萜的質量濃度在0.8～4.0 μg/mL范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質量濃度在0.4～8.0 μg/mL范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡便、可行，可用于測定破壁靈芝孢子粉中總三萜及多糖含量。

關鍵詞：破壁靈芝孢子粉;總三萜;多糖;分光光度法

靈芝孢子是靈芝在生長成熟期從靈芝菌褶中彈射出來的卵形生殖細胞，它的主要成分包含三萜類、多糖類、氨基酸多肽類、核苷酸與生物堿類等，具有抗腫瘤、抗氧化、調節血糖血脂和增強免疫調節等作用[1-3]。靈芝孢子為雙層細胞壁結構，由幾丁質和葡聚糖構成，質地堅韌，極難氧化分解，因此破壁處理后的靈芝孢子粉更有利于機體對孢內有效物質的消化吸收[4]。快速測定靈芝孢子粉中所含有效活性成分具有重要意義，本文采用紫外-可見分光光度法測定破壁靈芝孢子粉中的總三萜及多糖含量，并對測定方法的精密度、重復性及檢出限進行驗證。

1 材料

1.1 主要試劑

無水乙醇、冰乙酸、高氯酸、乙酸乙酯、香草醛、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、硫酸銅、無水硫酸鈉統一枸櫞酸鈉;標準品：齊墩果酸（1339），購于NATURE STANDARD公司;葡聚糖（S14110-100 g，Mw：1×105 g/mol），購于上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器

Cary50紫外-可見分光光度計（美國瓦里安），EL204分析天平（上海菁海有限公司），KQ-400KDE高功率數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），MTN-2800W氮吹濃縮裝置（天津奧特賽恩斯儀器），SC-3610低速離心機（安徽中科中佳）。

2 實驗方法

2.1 總三萜含量測定

稱取破壁靈芝孢子粉顆粒約0.2 g，置于100 mL容量瓶中，加入60 mL無水乙醇，水浴超聲提取（功率400 W，頻率40 kHz）45 min后，冷卻至室溫后，用無水乙醇定容，搖勻后過濾，吸取過濾液0.20 mL于10 mL具塞比色管中，氮吹使溶劑完全揮發。加入新配置的5%香草醛-冰乙酸溶液0.20 mL和高氯酸0.80 mL，搖勻。置于70 ℃水浴加熱15 min，取出，冰水冷卻5 min。加乙酸乙酯4.00 mL稀釋，搖勻，在546 nm波長下測定吸光度。

2.2 多糖含量測定

稱取破壁靈芝孢子粉顆粒5.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，加水80 mL左右，攪拌加熱回流1 h，冷卻至室溫后轉移至100 mL容量瓶中，定容至刻度，混勻后過濾。準確吸取過濾液5.0 mL，置于50 mL離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻5 min后，以3 000 r/min離心5 min，棄去上清液。殘渣用80%乙醇溶液數毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用水溶解并定容至5.0 mL。準確吸取終溶液2.0 mL，置于50 mL離心管中，加入100 g/L氫氧化鈉溶液2.0 mL、銅試劑溶液2.0 mL，沸水浴中煮沸2 min，冷卻，以6 000 r/min離心10 min，棄去上清液。殘渣用洗滌液數毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復操作3次，殘渣用10%硫酸溶液2.0 mL溶解洗滌并轉移至25 mL比色管中，加水稀釋至刻度，混勻，準確吸取樣品測定液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加入50 g/L苯酚溶液

1.0 mL，在渦旋混勻器上混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，渦旋混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻至室溫，在485 nm波長下測定吸光度待測。

3 結果與分析

3.1 波長選擇

分別移取0.50 mL齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）和2.00 mL葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL）至25 mL具塞比色管中，處理顯色后在紫外-可見分光光度計400～800 nm波長范圍內掃描，發現總三萜在546 nm波長下吸光度最佳，多糖在485 nm波長下吸光度最佳。

3.2 標準曲線繪制

分別移取齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）0.10、0.20、0.30、0.40 mL和0.50 mL于25 mL具塞比色管中，葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL）0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50 mL和2.00 mL于25 mL比色管中，處理顯色后再分別以試劑空白做參比，在546 nm和485 nm波長下測定吸光度值，以質量濃度（μg/mL）為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到總三萜線性回歸方程y=0.262 4x-0.014 3，R2=0.999 7，質量濃度范圍0.8～4.0 μg/mL;多糖線性回歸方程y=0.129 4x-0.013，R2=0.999 9，質量濃度范圍0.4～8.0 μg/mL。

3.3 精密度試驗

分別移取7份0.3 mL齊墩果酸對照品溶液（0.20 mg/mL）和0.6 mL葡聚糖對照品溶液（0.10 mg/mL），依照方法測定吸光度，計算7次結果的相對標準偏差，結果顯示總三萜RSD為1.54%，多糖RSD為1.99%，表明該方法的精密度良好。

3.4 重復性試驗

分別平行稱取7份破壁靈芝孢子粉顆粒0.2 g用于總三萜的重復性試驗，5.0 g用于多糖的重復性試驗，依照方法測定吸光度，計算7次結果的相對標準偏差，結果顯示總三萜RSD為1.91%，多糖RSD為2.18%，結果表明該方法的重復性良好。

3.5 加標回收率

分別取9份已知含量的供試品，對總三萜和多糖進行低、中、高3種濃度的加標回收率試驗，結果顯示總三萜回收率為88.0%～95.7%，多糖回收率為93.2%～98.0%，表明該方法的回收率良好。

4 結論

紫外-可見分光光度法是常見定量方法，因快速、簡單、性價比高，且具有一定的穩定性和重復性，因此在中藥質量分析中應用較多。本試驗針對線性、檢出限、精密度和回收率等進行方法驗證。結果表明，總三萜的質量濃度在0.8～4.0 μg/mL范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 7），方法精密度為1.54%，回收率為88.0%～95.7%。多糖的質量濃度在0.4～8.0 μg/mL范圍內呈良好的線性關系（r=0.999 9），方法精密度為1.99%，回收率為93.2%～98.0%。該方法簡單高效，完全滿足分析方法的要求。

參考文獻

[1]王瑛，金捷，金祖漢，等.靈芝孢子粉增強免疫功能的研究[J].中國現代應用藥學，2016，33（5）：544-546.

[2]劉艷榮，黃厚今.靈芝孢子粉功能作用的研究進展[J].中國食物與營養，2016，22（4）：65-69.

[3]劉春延，張國財，程方志，等.靈芝孢子粉破壁工藝優化及其抗腫瘤作

用[J].食品科學，2016，37（14）：51-55.

[4]林志彬，王鵬云.靈芝孢子及其活性成分的藥理研究[J].北京大學學報（醫學版），2006，38（5）：541-546.