食品大腸菌群檢驗中培養基驗證方法的探討

謝甜 陳亞

摘 要：培養基的質量直接關系到檢驗結果的準確性，在實驗開始前進行培養基的驗證具有極其重要的意義;GB 4789.3-2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》檢測標準中的檢測方法主要涉及結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST）、煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB）這3種培養基，通過對這3種培養基的驗證，評價培養基是否滿足實驗需要;并對可能造成培養基驗證結果不準確的因素進行分析討論。

關鍵詞：食品;大腸菌群;培養基;驗證

培養基是微生物檢驗中的主要耗品和材料。從培養基自身的質量來看，不同生產廠家的產品，甚至同一廠家不同批號的產品都會存在差異;依據GB/T 27050-2008《檢測和校準實驗室能力的通用要求》，對培養基的供應企業進行評價后選擇合格的供應商，這是培養基購買過程中的重要步驟。做好培養基和試劑的檢查工作，對確保微生物的生長、分離、鑒定與檢驗結果的正確性具有關鍵性的作用。因此，需要對培養基和試劑的質量進行檢查，以控制好培養基和試劑的質量[1]。培養基驗證是微生物實驗室質量控制的關鍵環節，驗證結果直接影響檢驗結果的準確性和質量，而大腸菌群是最為常見的檢測項目也是必檢項目，與人們的飲食健康息息相關，因此大腸菌群檢測的準確性至關重要[2]。參照GB 4789.28-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》[3]，從食品大腸菌群檢驗中培養基的驗證入手，闡述培養基驗證的具體操作流程，為實驗室內部的質量控制提供一定的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 培養基

1.1.1 待驗證培養基

結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA），批號：190812，廠家：北京陸橋技術股份有限公司;月桂基磺酸鹽胰蛋白胨肉湯（LST），批號：180509，廠家：北京陸橋技術股份有限公司;煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB），批號：190517，廠家：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.2 其他培養基（已驗證合格的培養基）

營養肉湯，批號：190829，北京陸橋技術股份有限公司;營養瓊脂，批號：190422，北京陸橋技術股份有限公司。

1.2 菌株信息

大腸埃希氏菌CICC 10305，中國工業微生物菌種保藏管理中心;糞腸球菌CICC 23658，中國工業微生物菌種保藏管理中心;弗氏檸檬酸桿菌ATCC 43864，KWIKSTIK。

1.3 儀器與設備

BSP-400L培養箱（S.15.17），上海博訊實業有限公司醫療設備廠;BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（S.17.3），蘇州安泰空氣技術有限公司。

2 培養基驗證方法

2.1 培養基制備

將VRBA培養基制好后倒入平皿，冷卻備用。將LST培養基分裝試管，每管10 mL;將BGLB培養基分裝試管，每管10 mL。滅菌后備用。

2.2 工作菌懸液制備

菌懸液A：將大腸埃希氏菌、弗氏檸檬酸桿菌和糞腸球菌菌株分別接種到營養肉湯中，36 ℃下培養24 h，即得3種工作菌懸液A。

菌懸液B：菌懸液A中的這3種工作菌懸液分別稀釋10、100、1 000與10 000倍，制備濃度為105～107 CFU/mL的菌懸液作為工作菌懸液;大腸埃希氏菌106 CFU/mL為工作菌懸液適宜濃度。弗氏檸檬酸桿菌，106 CFU/mL為工作菌懸液適宜濃度。糞腸球菌105 CFU/mL為工作菌懸液適宜濃度。

2.3 VRBA培養基驗證

2.3.1 生長率測試

接種：用1 μL接種環分別挑取菌懸液A中的大腸埃希氏菌菌懸液和弗氏檸檬酸桿菌菌懸液各一環在VRBA平板上劃線，各接種兩個平板，按圖1所示;在36 ℃培養箱培養24 h。

計算：每條有比較稠密菌落生長的劃線則生長指數G為1;僅一半的線有稠密菌落生長，則G為0.5;若劃線上沒有菌落生長、生長量少于劃線的一半或菌落生長微弱，則G為0;記錄每個平板的得分總和便得到G總。

VRBA生長率測試實驗結果如下。

大腸埃希氏菌（平均值）G總=7.5（要求G總≥6），特征性反應：大腸埃希氏菌有沉淀環的紫紅色菌落。

弗氏檸檬酸桿菌（平均值）G總=7（要求G總≥6）。

2.3.2 選擇性測試

接種：用1 μL接種環取菌懸液A中的糞腸球菌工作菌懸液1環，在VRBA平板上劃線，如圖2，同時接種兩個平板。在36 ℃培養箱培養 24 h。

計算：每條有比較稠密菌落生長的劃線則生長指數G為1;僅一半的線有稠密菌落生長，則G為0.5;若劃線上沒有菌落生長、生長量少于劃線的一半或菌落生長微弱，則G為0;記錄每個平板的得分總和便得到G總1。

VRBA選擇性測試實驗結果：糞腸球菌（平均值）G總1=3;（要求G總1<5）。

2.4 LST培養基驗證

2.4.1 測試

用1 μL接種環各取一環菌懸液B直接接種到LST培養基中，在36 ℃培養48 h。

2.4.2 結果解釋

目測濁度值評估培養基，0表示無混濁;1表示很輕微混濁;2表示嚴重的混濁。

生長率：大腸埃希氏菌濁度值=2（產氣）;弗氏檸檬酸桿菌濁度值=2（產氣）。

選擇性：糞腸球菌濁度值=0。

2.5 BGLG培養基驗證

方法與LST培養基驗證完全相同。

3 結論與分析

3.1 VRBA培養基驗證結論

3.1.1 標準要求

生長率測試：大腸埃希氏菌G≥6，且在VRBA平板上有特征性反應;選擇性測試：弗氏檸檬酸桿菌G≥6，糞腸球菌G<5。

3.1.2 結論

VRBA培養基驗證結果滿足上述要求，驗證結論合格。

3.2 LST培養基驗證結論

3.2.1 標準要求

大腸埃希氏菌：混濁度為2，且管內有氣體;弗氏檸檬酸桿菌：混濁度為2，且管內有氣體;糞腸球菌：濁度0（不生長）。

3.2.2 結論

LST培養基驗證結果滿足上述要求，驗證結論合格。

3.3 BGLB培養基驗證結論

標準要求與LST一樣，驗證結論為合格。

3.4 分析討論

培養基驗證過程中，也會出現不滿足實驗要求的情況，應該從以下幾個方面考慮：①試驗菌種，試驗菌種是否是目標菌，這一點涉及菌種的驗收是否合格，此外還要考慮菌種是否具有較強的生長力，最好是新鮮活化的。②操作規范，因為涉及3種菌株，在生物安全柜中同時操作極易造成交叉污染，對實驗準確度的影響極大，建議在不同的生物安全柜中操作，條件不允許的情況下可以分批次進行菌懸液的制備。③培養基自身的質量問題。對微生物檢驗來說，主要采用商品化脫水合成培養基。因此在采購商品化脫水合成培養基時，應仔細檢查外觀產品批號、有效期、培養基的pH值、包裝完整性等等，做好接收記錄。對于新開封的培養基，應記錄首次開封日，并在開封后6個月內用完。

4 結論

微生物種類很多且較復雜，檢驗結果的真實性與準確度會受到培養基質量的直接影響，培養基的驗證是內部質量控制的重要一環，本次實驗對GB 4789.28-2013《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求》中闡述的方法進行了細化，對實驗的可操作性進行了全面而具體的分析，盡管本次實驗的結果是滿意的，但實驗中還是存在各種風險，對實驗中的注意事項和可能存在的風險進行了總結與分析，為實驗室內部質量控制提供了良好的依據。

參考文獻

[1]林耀文，范安妮，劉海卿，等.淺談加強食品微生物檢驗質量控制的措施[J].生物技術世界，2014（8）：53.

[2]游元丁，趙陽，徐夢懷，等.奶粉中沙門氏菌檢測能力驗證分析[J].安徽農業科學，2019，47（5）：193-195.

[3]中華人民共和國國家衛生和計劃生育委員會.GB 4789.28-2013 食品微生物學檢驗 培養基和試劑的質量要求[S].北京：中國標準出版社，2013.