骨肉瘤組織中賴氨酸羥化酶2 表達(dá)情況及與病情程度的相關(guān)性分析

念其錢

福州市第二醫(yī)院病理科，福建福州 350007

骨肉瘤又稱之為成骨肉瘤， 是從間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來，發(fā)生后可出現(xiàn)疼痛、發(fā)熱、腫塊、跛行等癥狀，該病多發(fā)于兒童和青少年，惡性程度較高，對患者健康乃至生命安全造成嚴(yán)重威脅[1]。 目前臨床通過手術(shù)、放化療使骨肉瘤患者生存時間顯著增加， 但部分患者初診時就已經(jīng)發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，該類患者往往預(yù)后不良[2]。 準(zhǔn)確評估骨肉瘤患者病情程度，為臨床治療提供可靠依據(jù)，是改善患者預(yù)后的關(guān)鍵。 近年來研究發(fā)現(xiàn)賴氨酸羥化酶2 在膠原纖維沉積和重構(gòu)上有重要作用， 而骨肉瘤的發(fā)生與發(fā)展與膠原纖維的重構(gòu)和沉積密切相關(guān)，故認(rèn)為賴氨酸羥化酶2 與骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，不過其在骨肉瘤組織中的表達(dá)情況及與病情程度的關(guān)系的相關(guān)報道尚少[3]。 該研究方便選擇2017 年8 月—2019 年11 月的47 例骨肉瘤患者就此展開分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

方便選擇該院47 例骨肉瘤患者進(jìn)行研究，該次研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。 47 例患者包括男性27 例，女性20 例，年齡10~41 歲，平均年齡（21.57±6.43）歲；腫瘤位于脛骨或股骨38 例，其他部位9 例;Enneking 分期為Ⅰ期6 例，ⅡA 期13 例，ⅡB 期16 例，Ⅲ期12 例；軟組織浸潤29 例，無軟組織浸潤18 例；骨肉瘤細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14 例，未轉(zhuǎn)移33 例。 所有患者均取新鮮骨肉瘤腫瘤組織及癌旁正常組織為標(biāo)本， 采集標(biāo)本后快速放置于液氮中，并于-80℃環(huán)境下保存?zhèn)溆谩?納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)手術(shù)病理確診為骨肉瘤；②術(shù)前未接受任何治療；③簽署知情同意書；④資料完整。 排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在癌癥家族史；②合并其他系統(tǒng)性慢性疾病；③合并其他腫瘤性疾病；④合并其他影響檢測指標(biāo)的疾病。

1.2 方法

采用Westem bolt 法對PLOD2 的表達(dá)進(jìn)行檢測，以sh-PLOD2、sh-NC、LV-over/PLOD2、LV-vector 轉(zhuǎn)染U-2O S 細(xì)胞，常規(guī)進(jìn)行24 h 培養(yǎng)，取蛋白裂解液加入，冰上裂解1 h。 在4℃環(huán)境下以12 000 r/min 的速度進(jìn)行15 min 的離心處理，取上清液，采用蛋白質(zhì)定量（BCA）分析試劑盒測定蛋白濃度后， 放置于-80℃環(huán)境下儲存?zhèn)溆谩Ｈ?0 μg 蛋白質(zhì)在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，以半干法轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h， 加入一抗4℃過夜， 以緩沖液（TBST）進(jìn)行3 次洗膜。 加入二抗，于室溫下進(jìn)行2 h 孵育，再次以TBST 進(jìn)行3 次洗膜處理。 取化學(xué)發(fā)光顯色試劑加入，在暗室中拍攝X 線片顯影，進(jìn)行圖像掃描，以β-actin 為內(nèi)參照，使用凝膠圖像分析軟件對目標(biāo)條帶的灰度值進(jìn)行分析。重復(fù)進(jìn)行3 次實驗。PLOD2 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色為陽性， 根據(jù)染色強度與陽性細(xì)胞百分比計算免疫組化染色得分， 得分1~4 分為低表達(dá)，＞4 分為高表達(dá)。 免疫組化染色及評分方法：石蠟切片常規(guī)烤片，并進(jìn)行逐級脫蠟、脫水處理，經(jīng)3%H2O2孵育以將內(nèi)源性過氧化物酶活性消除， 然后置于10%山羊血清封閉， 加入一抗后于室溫進(jìn)行1 h 的孵育，經(jīng)PBS 沖洗后加入二抗，再于室溫進(jìn)行15 min 的孵育，二氨基聯(lián)苯胺顯色后蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，在二甲苯透明之后封片，以PBS 替代一抗作為陰性對照。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察比較PLOD2 在骨肉瘤組織、 癌旁正常組織中的陽性表達(dá)情況， 同時比較不同Enneking 分期患者PLOD2 表達(dá)及骨肉瘤細(xì)胞有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者、 軟組織有無浸潤患者PLOD2 表達(dá)情況，分析PLOD2 與骨肉瘤分期及是否轉(zhuǎn)移、軟組織浸潤的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以頻數(shù)及百分比表示，組間差異比較以χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 檢驗。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLOD2 陽性表達(dá)情況

PLOD2 在骨肉瘤組織中的陽性表達(dá)率為72.34%，在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率為6.38%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；不同Enneking 分期患者PLOD2 表達(dá)顯示，Ⅰ~ⅡA 期的陽性表達(dá)率為52.63%，與ⅡB~Ⅲ期85.71%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移患者PLOD2 表達(dá)陽性率為92.86%，軟組織浸潤患者陽性表達(dá)率為75.86%，與未轉(zhuǎn)移、未發(fā)生軟組織浸潤比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 PLOD2 陽性表達(dá)情況對比[n(%)]

2.2 Pearson 相關(guān)性分析

經(jīng)Pearson 相關(guān)性分析顯示，PLOD2 與骨肉瘤ⅡB~Ⅲ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、軟組織浸潤呈正相關(guān)性（r=0.698、0.663、0.711， P＜0.05）。

3 討論

骨肉瘤是多發(fā)于20 歲以下青少年或兒童的一種常見惡性腫瘤， 目前針對該病的治療尚無特效治療手段， 雖然諸多研究顯示輔助化療能夠促進(jìn)患者預(yù)后改善，但疾病復(fù)發(fā)患者預(yù)后仍較差，因此探索新的治療方式促使骨肉瘤患者生存率有效提高意義重大[4]。 研究認(rèn)為骨肉瘤的發(fā)病機制可能與生長因子、抑癌基因、染色體等因素有關(guān)，但對于骨肉瘤侵襲、轉(zhuǎn)移分子機制尚不明確， 臨床在使用抑制骨肉瘤細(xì)胞侵襲、 遷移的藥物時，缺乏判斷骨肉瘤病情程度變化的敏感生物標(biāo)志物，因此針對該方面的研究是當(dāng)前重點課題[5-6]。

PLOD2 是一種介導(dǎo)膠原賴氨酸羥化的酶， 相較于非羥化賴氨酸殘基， 羥化賴氨酸殘基能夠產(chǎn)生更強的膠原交聯(lián)穩(wěn)定性，PLOD2 能夠通過膠原修飾及細(xì)胞外基質(zhì)重塑介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移，其在腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)可改變膠原交聯(lián)腫瘤基質(zhì)，促使膠原纖維形成，進(jìn)而造成腫瘤細(xì)胞侵襲、遷徙[7-8]。有研究發(fā)現(xiàn)，PLOD2 高表達(dá)能夠促進(jìn)膠原纖維交聯(lián)，使腫瘤病灶處的膠原纖維的沉積增加， 進(jìn)而誘發(fā)癌細(xì)胞淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移， 不過關(guān)于PLOD2 在骨肉瘤中表達(dá)情況的研究報道尚少[9-10]。 該研究結(jié)果顯示，PLOD2 在骨肉瘤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于在癌旁正常組織中的陽性表達(dá)率，說明在骨肉瘤腫瘤組織中PLOD2 呈高表達(dá)，其在骨肉瘤診斷中具有重要作用。 PLOD2 是一種膠原蛋白修飾酶，而膠原蛋白類似于層粘蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白等，是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，能夠?qū)M織內(nèi)穩(wěn)態(tài)、 炎癥、 器官發(fā)育及癌癥等進(jìn)行調(diào)節(jié)， 因此PLOD2 異常表達(dá)可對細(xì)胞外基質(zhì)造成破壞， 促進(jìn)細(xì)胞侵襲、遷移[10]。而且PLOD2 下游信號通路中的己糖激酶2、整合素A3 也可能對其表達(dá)產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號，引起腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移情況[11]。 樊李瀛等[12]研究中也認(rèn)為骨肉瘤腫瘤組織中PLOD2 基因表達(dá)水平較癌旁正常組織明顯更高，這與該研究結(jié)果一致。 而且該研究結(jié)果顯示腫瘤分期與PLOD2 表達(dá)呈正相關(guān)，骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、 軟組織浸潤患者的PLOD2 表達(dá)陽性率分別為79.03%、75.76%，明顯高于未轉(zhuǎn)移、未浸潤者，該研究結(jié)果中骨肉瘤Enneking 分期為Ⅰ~ⅡA 期的PLOD2 陽性表達(dá)率明顯低于ⅡB~Ⅲ期，骨肉瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、軟組織浸潤患者的PLOD2 表達(dá)陽性率分別為92.86%、75.86%，明顯高于骨肉瘤細(xì)胞未轉(zhuǎn)移、軟組織未浸潤的患者，與上述研究結(jié)果大致相同，說明PLOD2 的表達(dá)隨著骨肉瘤患者病情程度的加重而增高。 該研究進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析顯示，PLOD2 與骨肉瘤ⅡB~Ⅲ期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、軟組織浸潤呈正相關(guān)性，充分印證了上述研究結(jié)論。

綜上所述，PLOD2 在骨肉瘤組織中呈高表達(dá)，其陽性表達(dá)與骨肉瘤分期及轉(zhuǎn)移、軟組織浸潤呈正相關(guān)性，可作為臨床判斷病情進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)。