哺乳動物乳鐵蛋白的研究進展

文/郝文文 蘭欣怡

（湖南農業大學動物科技學院）

1 乳鐵蛋白概述

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是一種重要的非血紅素鐵結合糖蛋白，主要是由哺乳動物的乳房分泌的一種物質，即外分泌腺和中性粒細胞分泌的具有鐵結合功能的陽離子糖蛋白[1]，分子量約80 kDa。體液中的乳鐵蛋白分為不含鐵、單三酸和雙三酸3 種形式[2]，是轉鐵蛋白（Transferrin，Tf）家族的成員之一，在轉鐵蛋白家族中乳鐵蛋白對鐵的親和力最強[3]。乳鐵蛋白具有8.9的等電點（pI），在低于其pI的pH環境下帶正電荷，可以與具有負電荷的蛋白質形成各種超分子結構[4]。

乳鐵蛋白多分布在哺乳動物的淚液、唾液、血漿、膽汁、胰液以及小腸液中，少量存在于骨髓、血液中的中性粒細胞（PMN）、子宮內膜及胎盤，人乳鐵蛋白還具有預防新生兒敗血癥和壞死性小腸結腸炎[5]，保護新生兒免受感染的作用，同時乳鐵蛋白還能促進神經發育和認知[6]、刺激成骨細胞的增殖[7]和分化[8]、并抑制破骨細胞的形成[9]。

乳鐵蛋白結構和性質較復雜，在生產方面，研究主要集中在人乳鐵蛋白和牛乳鐵蛋白。王慧在論文中闡述，1939年，Sorensen首次在牛乳中一個未知的“紅色組分”中發現，牛乳鐵蛋白是一條由689 個氨基酸組成的單鏈多肽[10]。乳鐵蛋白的氨基酸序列，包含2 個葉，在每個葉上包含1 條聚糖鏈并結合1個Fe3+[11]，其表面是由堿性氨基酸構成的糖胺多糖結合區域在靜電引力結合下帶有高度負電荷的硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）[12]。

2 乳鐵蛋白的生物學功能

乳鐵蛋白具有多種生物功能，例如免疫調節功能，與鐵的結合能力，抗菌、抗病毒和抗氧化作用，鐵誘導的脂質過氧化保護，參與機體免疫調節，增強機體抗病能力等。

2.1 免疫調節功能

免疫調節作用是乳鐵蛋白生物活性之一，可通過誘導體液免疫反應，促進抗原特異T細胞活性，調節細胞因子mRNA表達水平，影響淋巴細胞增生等途徑發揮其免疫調節功能[13]。目前已證實乳鐵蛋白可促進PMN、巨噬細胞對細菌的貪食以及細菌內的殺菌作用；促進PMN聯合白細胞介素（Interleukin，IL）-28的放出；活化自然殺傷細胞（Natural Killer cell，NK）；抑制粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor，GM-CSF）的產生以及放出；抑制淋巴球的RNA翻譯；抑制混合淋巴球的IL-21、IL-22以腫瘤壞死因子（TNF）的放出；抑制補體活性化等[14]。

乳鐵蛋白在消化道酶水解作用下會釋放具有生物活性的肽段——乳鐵蛋白素[15]。，可促進腸道免疫，并具有顯著作用，乳鐵蛋白與免疫球蛋白和其他保護性因子相協調參與局部分泌免疫，并主要作用于靶細胞和靶細胞表面非特異性受體上，同時減少細胞損傷和促進損傷愈合作用，通過促進PMN在受傷部分的吸附和聚集，增加粒細胞黏性，促進細胞間的相互作用，調節免疫球蛋白的分泌，參與調節機體免疫耐受力，抑制補體系統的激活或激活已有的補體途徑。大量試驗研究表明，乳鐵蛋白參與神經營養因子通路、參與機體代謝調節[16]，促進體液免疫。李娜等[17]對乳鐵蛋白免疫調節作用的研究表明，乳鐵蛋白具有明顯的抑制小鼠外周血單個核細胞增殖的作用，且乳鐵蛋白的抑制作用與其濃度存在相關性。當乳鐵蛋白的濃度大于100 μg／mL時，抑制作用顯著；當濃度為1 000 μg／mL時，抑制非常作用顯著[18]。

2.2 乳鐵蛋白與鐵的結合能力

乳鐵蛋白的許多生物活性與其鐵飽和度和在不同作用條件下對鐵的釋放能力有關，這是因為乳鐵蛋白中結合鐵的多少會影響其分子構象。乳鐵蛋白的結構雖然和血清轉鐵蛋白、血漿或乳漿中的轉鐵蛋白相似，但是其和鐵離子之間的親和力度較高，親和常數約1 025，親和能力是其他轉鐵蛋的260 倍[19]。因此，乳鐵蛋白通過穩定還原態下的鐵離子，來提高腸黏膜細胞細胞對鐵的利用率，減少對腸道的刺激。與無鐵乳鐵蛋白對比，具有與鐵結合能力的乳鐵蛋白結構緊湊[20]，因為其每個氨基末端葉片和羧基末端葉片結構中都含有鐵離子和碳酸氫根結構，和鐵高度且可逆的結合（圖1）。不同來源的乳鐵蛋白在結構上相似，但不完全相同，因此，在某些活性方面也存在差異。氨基酸組成的結構域中存在乳鐵蛋白中的鐵元素，之間的裂縫可以通過葉子的結構變化而處于打開或關閉狀態，當鐵離子和多肽鏈相互結合時，裂縫閉合。研究人員還根據乳鐵蛋白結合鐵離子的數量，把乳鐵蛋白分為鐵飽和型乳鐵蛋白、鐵半飽和型乳鐵蛋白和缺鐵型乳鐵蛋白3 種類型[21]。

乳鐵蛋白可以促進腸黏膜細胞對鐵元素的吸收，達到人體對鐵元素需要的平衡態，可治療妊娠缺鐵性貧血[22]。但是，如果人體缺乏鐵調節蛋白（IRPs）類的反饋回路，鐵可以持續向大腦運輸，可能會使大腦的鐵含量增加到病理水平，從而引發阿爾茨海默病和帕金森氏病等神經退行性疾病[23]。

同時乳鐵蛋白還有抗氧化作用，乳鐵蛋白通過螯合Fe3+，減少羥自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH自由基）的產生，具有抗氧化作用。此外，乳鐵蛋白可以抑制硫代巴比妥酸（TBA）和丙二醛（MDA）的生成；非飽和乳鐵蛋白可以隔離自由鐵，保護糖蛋白不被氧化劑氧化[24]。

2.3 消炎及抗腫瘤作用

由于牛乳鐵蛋白能與鐵特異性結合，因其生物學特性而廣泛應用于功能性和治療性產品，其中最重要的是抗菌活性[25]。基于其與鐵的結合能力強、可直接結合到微生物膜上、可阻止微生物附著在上皮細胞或腸上皮細胞上3 個方面，而具有消炎作用。有研究人員發現，在有免疫球蛋白A（IgA）和溶菌酶存在的情況下，乳鐵蛋白的抗微生物感染能力會增強。袁渝萍等[26]研究發現重組人乳鐵蛋白能夠抑制幽門螺桿菌的生長及增殖，且能不同程度地抑制幽門螺桿菌毒力因子及蛋白的表達，降低幽門螺桿菌致病性。Angulo-Zamudio等[27]研究的乳鐵蛋白分解肺炎球菌生物膜發現，雖然乳鐵蛋白抑制了肺炎鏈球菌在人類呼吸細胞上的定植，但是不影響浮游細菌的生存能力。

圖1 乳鐵蛋白的分子結構

研究表明，乳鐵蛋白可能會干預侵入性惡性腫瘤細胞，預防致命細菌穿透宿主組織[28]。同時乳鐵蛋白也是一種廣譜抗病毒劑，主要用于病毒感染的早期階段，其首先直接結合病毒顆粒，從而抑制其對靶細胞的入侵；其次根據靶細胞表面的病毒受體結構，進一步切斷病毒與靶細胞；最后抑制病毒進入靶細胞后的自我復制過程，干擾病毒對靶細胞的吸附和侵襲，以此達到抗病毒作用。Gu Y等[29]通過高效液相色譜分離以及氧化物水平基底氧化測試后發現，牛乳鐵蛋白中提取的血管緊張素轉換酶抑制三肽低密度脂蛋白受體相關蛋白（lowdensitylipoproteinreceptorrelatedprotein，LRP），具有抗氧化和抗炎及潛在的抗高血壓作用。乳鐵蛋白屬于非特異性免疫分子激活劑，可增強免疫細胞的殺傷作用，提高機體的抗病毒作用，抵抗病毒對人體引起的不良反應[30]，還可以使重癥社區獲得性肺炎患者外周血中的白細胞計數、中性粒細胞、降鈣素原等在一定的時間之內產生下降趨勢[31]。乳鐵蛋白能促進正常細胞增殖，但對癌細胞卻是起阻止而非刺激作用。乳鐵蛋白通過阻礙體外培養的癌細胞由G1期向S期轉化，并誘導改變細胞周期中一些重要調節蛋白的表達水平或活性，達到抑制腫瘤細胞增殖的作用。此外，乳鐵蛋白能夠抑制內皮細胞的功能而發揮抗血管生成的作用。最新研究表明，乳鐵蛋白能通過減少炎癥或誘導細胞增殖，降低或修復由過氧化氫誘導的小腸上皮細胞損傷，研究者認為乳鐵蛋白可作為一種預防和恢復腸道上皮損傷的潛在干預手段[32]，同時有些研究人員在妊娠母豬后期的飼料中加入了乳鐵蛋白，發現乳鐵蛋白不但可以提高幼崽初生重以及出生窩重，還可以提高仔豬的抗病能力[33]。

2.4 其他生物學功能

2.4.1 具有抗食物性病原體活性

食物性病原體阪崎腸桿菌（Cankobacter sakazakii）是一種依靠食物來傳播的病原體，主要影響新生兒健康。科學家根據評估天然和鐵飽和的牛乳鐵蛋白對非干燥和干燥Cankobacter sakazakii的抗菌活性。試驗結果表明，牛乳鐵蛋白對Cankobacter sakazakii的抗菌作用主要是鐵的螯合作用，通過與磷酸鹽緩沖液比較，發現天然牛乳鐵蛋白對非干燥Cankobacter sakazakii的抗菌活性在乳或乳清中顯著降低；但同樣條件下，對干燥Cankobacter sakazakii的抗菌性仍然存在[34]。

2.4.2 具有多種酶活性

在最新的研究結果中表明，牛乳鐵蛋白類似于人乳鐵蛋白，具有脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的活性。科學家運用了不同的方法，表明乳鐵蛋白擁有較高的過氧化物酶、蛋白酶、淀粉酶、蛋白酶和磷酸酶活性，且其蛋白酶活性是被鎂離子和鈣離子激活，其中具有ATP酶的活性的牛乳鐵蛋白的只占3/7。同時，研究人員Svetlana等[35]發現，乳鐵蛋白制劑具有不同水平的金屬依賴性DNA酶和不依賴金屬的RNA酶活性。原有的分析顯示，脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的活性僅在對應的同類乳鐵蛋白凝膠地方起作用。和人乳鐵蛋白對比，牛乳鐵蛋白對于人類腫瘤細胞具有較低的毒性。這些發現可以幫助理解這種多功能蛋白的多種生理功能，包括一些抵抗微生物和病毒感染的作用[36]。倘若生產時不注意衛生，就會讓原本存在于牛乳中價值非常高的乳鐵蛋白因衛生條件不加從而導致牛奶不能最大化利用，例如，埃塞俄比亞南部的阿瓦薩地區的奶牛所產的牛奶研究表明，分離出的金黃色葡萄球菌對青霉素G（PG）（10 μg），氨芐青霉素（AP）（10 μg）苯唑西林（Ox）（1 μg）產生了較強的耐藥性，使得在人體中可以檢測到部分的金黃色葡萄球菌，從而使牛奶中營養物質不能得到很好的表現[37]。

3 其他特性

3.1 過氧亞硝酸鹽對乳鐵蛋白的影響

以10：1摩爾比使用ONOO—（氧亞硝基陰離子）與酪氨酸處理，可以抑制天然乳鐵蛋白的所有抗菌活性。硝化產品中Fe3+使α-螺旋特性顯著降低，部分蛋白質展開，使牛乳鐵蛋白保護細胞免受損能力下降。

同時，乳鐵蛋白的鐵結合能力在用過氧化亞酸鹽治療后也在減少，意味著乳鐵蛋白防止細胞損傷的能力下降。再通過LC-MS/MS光譜測定法來鑒定乳鐵蛋白肽硝化片段及包括在結合鐵區域的酪氨酸殘基Y92，這表明其通過過氧化亞酸鹽的翻譯后修改的乳鐵蛋白，可能作為一個重要的加劇感染的途徑[38]。

3.2 運用轉基因奶牛、山羊群，生產重組人乳鐵蛋白

與其他動物相比，人乳鐵蛋白更適于人類食用，但一般情況下，人在非哺乳期不會產奶。隨著全球對牛（羊）奶制品需求量增多[39]，科學家尋找合適的系統來進行人乳鐵蛋白基因的異源表達。通過試驗研究表明，在常用的表達系統中，人乳鐵蛋白基因表達較為合適的器官是動物乳腺[40]，使用陽離子交換色譜凈化原生態山羊乳鐵蛋白，從而得到重組人乳鐵蛋白。同時，不同的分析方法，如分光光度法等揭示，重組人乳鐵蛋白是一個糖蛋白，且理化特征和原生態人乳鐵蛋白相似，抑菌活性相似，消化性能穩定，鐵離子結合和釋放活力以及糖基化修飾相似[41]，并可促進成骨細胞的增殖分化[42]。

在SD大白鼠試驗中，經科研人員長時間喂養得知，對SD大白鼠飼喂人乳鐵蛋白全乳粉尚未出現安全問題，并且乳鐵蛋白可能通過提高骨保護素（OPG）/細胞核因子KB受體活化因子配體（RANKL）正確比值，增加骨量和減少骨損失[43]，通過促進骨形成進一步維持骨代謝平衡，同時還可提高SD大白鼠機體鐵的營養狀況[44]，這意味著其可作為一個有前途的生物制藥和食品補充劑[45]。

3.3 鹽酸四環素與牛乳鐵蛋白

根據熱力學參數和分子嵌合進一步顯示靜電力力量，牛乳鐵蛋白和鹽酸四環素結合時需要使用到范德華力和氫鍵結合力。通過圓二色光譜等方法證實了牛乳鐵蛋白確實和鹽酸四環素有聯系，并引起了牛乳鐵蛋白的構造變化，再通過對牛乳鐵蛋白表面的疏水性變化的分析，進一步研究牛乳鐵蛋白和鐵離子之間的捆綁力是否是因鹽酸四環素對蛋白質功能產生了影響，從而使得捆綁力發生了變化。最后發現，牛乳鐵蛋白和鹽酸四環素之間相互作用，且兩者之間的結合力非常強[46]。

4 乳鐵蛋白的檢測方法

根據現如今資料顯示，對乳鐵蛋白的檢驗方法主要有4 種：毛細管電泳[47]、高效液相色譜法[48]、分光光度法[49]、酶聯免疫吸附法[50]。

4.1 毛細管電泳

近些年來，有科學家研究發現用毛細管電泳可以高效篩選牛乳鐵蛋白適體[51]，通過采用不同測序深度的高輸出和中輸出2 種方法進行新一代測序。他們通過建立動態涂層毛細管電泳快速檢測乳鐵蛋白含量的方法，分析該方法對乳鐵蛋白檢測及純度的驗證是否有效[52]。此外，通過分子動力學模擬分析結合位點、相互作用力和結合自由能，來驗證候選分子和牛乳鐵蛋白的結合力。多次試驗后發現，樣品奶粉的牛乳鐵蛋白檢測結果與標示濃度基本一致[53]。

4.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法可以用來測定牛乳鐵蛋白在無菌乳制品、發酵乳制品、嬰幼兒配方食品等中的含量，同時還能測定不同品種牛奶中乳鐵蛋白的含量。由于高效液相色譜法沒有長時間的預處理以及分離層次，添加簡單的預處理步驟是為了移除酪蛋白家族的脂肪和蛋白質，使得不同品種的乳汁對乳鐵蛋白的洗滌程度不同，乳清中乳鐵蛋白的洗脫量也不同，雖然對于有些樣本如綿羊、奶牛及驢的乳汁所展示的峰的分辨率比較滿意，但是觀測山羊和人類的乳汁時，其峰分辨率會被其他峰干涉，但是乳鐵蛋白的定量對所有樣本都是可能的。通過改進的肝素親和層析柱高效液相色譜法能使被測物種的乳汁樣品中乳鐵蛋白的測定成為可能，即可用于日常分析，也可作為一種定性篩選，來確保乳鐵蛋白是否存在[54]。先在pH=8的磷酸鹽緩沖液中將牛乳鐵蛋白提取出來，在肝素親和層析柱中洗滌，并在280 nm下使用C4層析柱高效液相色譜法檢測和二極管陣列檢測器檢測。該方法提供了一個線性監測范圍。10～1 000 μg/mL的定性限樣品——0.6 mg/100 g液體樣品和3.0 mg/100 g固體樣品，以及定量限樣品——2.0 mg/100 g液體樣品和10.0 mg/100 g固體樣品。此外，該方法讓76%～96%的樣品有更好的回收率，具有容易處理，靈敏度高以及精確度良好，回收率較高以及檢測廉價的優勢[55]。

根據李莉等[56]對比分析過乳鐵蛋白酶聯免疫檢測試劑盒法和高效液相色譜法對嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量進行測定結果，最后發現這兩種方法的測定結果無顯著性差異，都可以被用來測定嬰幼兒食品中乳鐵蛋白含量。

4.3 分光光度法

分光光度法可以用來測定乳鐵蛋白濃度，由于該方法對儀器設備的要求較低，因此，可以迅速測出乳鐵蛋白的含量，但其準確度不高[57]。通常用于工廠分離提純過程中的快速檢測或是分析對檢測結果準確度要求不高的樣品分析。

4.4 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附法靈敏度較高，操作較簡單[58]，可以快速的檢測出奶粉中的乳鐵蛋白含量[59]。

5 總結

乳鐵蛋白結構復雜，能夠和鐵離子親密結合，同時還具有抗菌、抗病毒和抗氧化，參與機體免疫調節，增強機體抗病能力等作用，因而被運用在醫療、食品、藥品等諸多領域。目前乳鐵蛋白提取的量較少，但未來可以通過研究新方法提取出比率更多的乳鐵蛋白。因此，乳鐵蛋白的發展前景非常廣闊，未來的研究方向主要是如何提取出更優質的乳鐵蛋白應用于人類健康領域。