檢測水痘-帶狀皰疹病毒糖蛋白水平雙抗體夾心ELISA 法的建立和驗證

朱琨瑩, 郭世杰, 袁若森, 潘 東, 張 春, 陳曉旭, 衣延明, 楊 陽, 鄭柏松, 姜春來

（1.吉林大學第一醫院艾滋病與病毒研究所，吉林 長春 130021；2.吉林大學第一醫院新生兒科，吉林 長春130021；3.長春百克生物科技股份公司，吉林 長春 130012；4.吉林大學生命科學學院微生物免疫系，吉林 長春 130012）

水痘－ 帶狀皰疹病毒（varicella zoster virus，VZV） 屬皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科，以人類為其唯一自然宿主且具有嗜神經性［1-3］。水痘多好發于兒童，初次感染會出現發熱和皮疹等癥狀，病愈后少量病毒會終身潛伏于宿主感覺神經節的神經細胞中［4-6］。若宿主高齡或機體免疫力降低時，潛伏的病毒會被再次激活并大量增殖，對皮膚細胞和局部神經產生損傷，從而形成帶狀皰疹［7］。帶狀皰疹的患病率和嚴重程度隨著年齡增加而升高，尤其50 歲后明顯升高［8-10］，可反復發作，愈后神經痛可持續數月甚至數年，嚴重影響患者的身心健康。目前，對于水痘和帶狀皰疹的治療尚無特效方法，接種疫苗是唯一有效且可靠的預防控制手段。

我國現行用于預防水痘和帶狀皰疹疾病的疫苗中主要成分多為水痘減毒活病毒OKA 株［11］。在疫苗的研發和生產過程中，病毒滴度作為其主要質控項目，需要在多個步驟中進行多次檢測。經典的VZV 滴度檢測方法（藥典方法） 為蝕斑法［12］，該方法包括培養細胞、感染病毒、染色、計數和判定等步驟，檢測周期至少7 d （不包括染毒前細胞傳代的時間），因此在某些需要根據病毒滴度結果進行下一步驟操作的生產環節中，該方法會成為研發與生產的限速環節。同時，該方法需要檢測人員具有較強的無菌操作技術和相關實驗經驗，來完成細胞建庫、復蘇和傳代等步驟及斑塊的人工計數；且檢測細胞均為人二倍體細胞，在細胞庫建立和維護方面花費的成本較大。有研究［13］采用PCR 法擴增病毒以快速檢測VZV 病毒滴度，可將檢測時間縮短至24 h （感染病毒后），且該方法與蝕斑法檢測結果無明顯差異，但要根據VZV 病毒基因設計引物和探針，試驗過程需要PCR 法與熒光定量檢測系統，對檢測設備的要求較高。因此，開發一種能快速、準確、低成本、且對人員操作經驗要求低的檢測病毒滴度的方法，對蝕斑法進行替代，作為疫苗研發與生產過程中的檢測方法，可大大加快研究進程，縮短生產過程中的檢測時間。

VZV 表面的糖蛋白至少有8 種，集中存在于病毒的囊膜和感染細胞的胞膜中，與病毒的致病性與免疫原性有密切關系［14］。有報道［15-16］針對VZV 表面糖蛋白進行ELISA 雙抗體夾心定量方法的開發，但該方法中應用的單克隆抗體為雜交瘤所產生，且酶標抗體為IgG2a 類型，抗體的批間差異較大，不易質控，從而導致方法穩定性差。本研究以IgG1類型的針對空間構象表位的基因工程單抗為基礎，針對抗原性最強的IgE 糖蛋白進行研究，建立更穩定、 更準確的ELISA 雙抗體夾心定量檢測方法，為疫苗的研發和質控提供依據。

1 材料與方法

1.1疫苗、病毒和參考品

水痘減毒活疫苗（Var）、水痘減毒活疫苗參考品、百白破疫苗（DPT）、狂犬疫苗（PM 株） 和流感減毒活疫苗由長春百克生物制品有限公司提供，流感裂解滅活疫苗為長春生物制品所有限責任公司產品，狂犬疫苗（aG 株） 為寧波榮安生物藥業有限公司產品，HPV-18 型純化液由吉林大學生命科學院實驗室提供。

1.2主要試劑和儀器

抗VZV 糖蛋白的基因工程抗體VZV-mAb-01、VZV-mAb-02、 VZV-mAb-03、 VZV-mAb-04、VZV-mAb-05、 VZV-mAb-HRP-01、 VZV-mAb-HRP-02 和VZV-mAb-HRP-03 由長春百克生物科技股份公司提供， 人血清白蛋白（human serum albumin， HSA） 購自奧地利國奧克特琺瑪公司，牛血清購自北京希凱創新科技有限公司，脫脂奶粉購自蒙牛乳業， 牛血清白蛋白（bovine serum albumin， BSA） 購自新西蘭Proliant New Zealand公司，精氨酸購自上海協和氨基酸有限公司，谷氨酸鈉購自湖南新綠方藥業有限公司，尿素購自湖南芙蓉制藥有限公司，氯化鈉購自河北華晨藥業有限公司，海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和甘氨酸購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。全自動酶標儀（iMark） 和微孔板洗板機（1575） 購自美國Bio-Rad 公 司， CO2培 養 箱（311） 購 自 美 國Thermo 公 司， 電 子 天 平（A1104） 購 自 美 國Mettler Toledo 公司。

1.3檢測方法的建立

1.3.1 篩選捕獲抗體和酶標抗體組合 根據說明書所提供的濃度， 將5 種捕獲抗體（VZV-mAb-01、 VZV-mAb-02、 VZV-mAb-03、 VZV-mAb-04和VZV-mAb-05） 分 別 稀 釋 至1 mg·L－1， 每 孔100 μL 包被 酶標板； 抗 原為100 倍稀釋的VZV，加入陽性孔中， 對應的陰性孔加入1%BSA ［含1% BSA 的0.5% 磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST），pH 值為7.4±0.1］ 溶液；將3 種酶標抗體（VZVmAb-HRP-01、 VZV-mAb-HRP-02 和VZV-mAb-HRP-03） 分別稀釋至0.1 g·L－1，將每種酶標抗體稀釋為低、中和高濃度，分別加入不同捕獲抗體包被的酶標板中，以確保每種捕獲抗體與每種酶標抗體均進行交叉實驗，檢測450 nm 處捕獲抗體與酶標抗體的陽性樣品（VZV） 與陰性樣品（1%BSA） 的吸光度（A） 值，其比值即陽性值／陰性值（positive value/negative value， P/N）， P/N 比值越大， 對應的捕獲抗體與酶標抗體的組合越優［17-18］。

1.3.2 捕獲抗體和酶標抗體工作濃度的選擇 將“1.3.1” 步驟中篩選出來最優包被抗體與酶標抗體組合用棋盤滴定法進行最適濃度的篩選。將捕獲抗體以1∶2 500（900 μg·L－1）、1∶5 000（450 μg·L－1）、1∶7 500 （338 μg·L－1） 和1∶10 000（225 μg·L－1） 進行包被，酶標抗體分別以1∶2 000 （0.28 μg·L－1）、1∶4 000（0.14 μg·L－1）、1∶6 000 （0.09 μg·L－1）、1∶8 000 （0.07 μg·L－1） 和1∶10 000 （0.05 μg·L－1）進行交叉實驗，以P/N 比值最大值所對應的濃度作為包被抗體和酶標抗體的最適工作濃度。

1.3.3 包被條件的選擇 包被液的選擇：分別以0.05 mol·L－1CBS 緩沖液（pH 9.6）、0.05 mol·L－1PBS 緩沖液（pH 7.4）、0.05 mol·L－1Tris-HCl 緩沖液（pH 6.6） 和0.05 mol·L－1Tris-HCl 緩沖液（pH 8.8） 為包被抗體稀釋液，稀釋相同濃度的包被抗體進行酶標板包被，以P/N 比值最大值所對應的該種包被稀釋液為最適包被液。包被溫度和時間的選擇：以最適包被液包被酶標板， 分別置于4℃過夜，采用37 ℃、1 h，37 ℃、2 h 和37 ℃、3 h 條件進行包被，其他步驟均相同，檢測450 nm處A 值，綜合A 值和P/N 比值，選擇2 個數據均較大的包被條件為最適包被條件［19］。

1.3.4 封閉條件的選擇 分別以 1%BSA、3%BSA （含3% BSA 的0.5% PBST 緩 沖 液，pH 值為7.4±0.1）、5% 脫脂奶粉和10% 新生牛血清作為封閉劑，其他步驟均相同，綜合P/N 比值最大值和檢測值的范圍確定最適封閉劑。對比不同封閉條件（37 ℃、1 h 和37 ℃、2 h） 下的檢測值，確定最適封閉條件。

1.3.5 夾心抗原和酶標抗體反應條件的選擇 樣品稀釋液的選擇：分別以1%BSA、0.5%PBST （含0.5% 吐 溫-20 的PBS 緩 沖 液，pH 值 為7.4±0.1）和PBS 緩沖液（pH 值為7.4±0.1） 為樣品稀釋液，稀釋VZV 與酶標抗體，以P/N 比值最大值所對應的該種稀釋液為最適樣品稀釋液。

夾心抗原與酶標抗體反應時間的確定：采用最適包被液稀釋包被抗體至最適濃度后，稀釋相同濃度的夾心抗原，保證后續步驟中酶標抗體37 ℃、1 h 反應條件下，夾心抗原37 ℃分別作用30、45、60、75 和90 min，采用ELISA 法檢測A （450） 值并計算P/N 比值，以確定夾心抗原的最適反應時間；夾心抗原于37℃、1 h 反應條件下，酶標抗體于37℃條件下分別作用30、45、60、75 和90 min，采用ELISA 法檢測A （450） 值并計算P/N 比值，以確定酶標抗體最適反應時間。

1.3.6 顯色條件的選擇 顯色溫度為37℃時，采用TMB 終 點 法 測 定 顯 色5 、 10 、 15 、 20 、 25 和30 min 時的A （450） 值，并計算P/N 比值。綜合P/N 比值與陰性對照的A （450） 值，選擇P/N 比值較大且陰性對照A （450） 值較小的顯色時間為最適顯色時間。

1.4檢測方法的驗證

1.4.1 特異性驗證 采用建立的雙抗體夾心法以相同的樣品稀釋倍數（10、30、90 和270 倍） 檢測Var、 凍干人用狂犬病疫苗aG 株與PM 株（RabaG、 Rab-PM）、 凍干流感減毒活疫苗（LAIV）、流感裂解滅活疫苗（TIV）、DPT 和HPV-18 型病毒純化液（HPV-18）；市售多家水痘減毒活疫苗中輔料成分： HSA、海藻糖、谷氨酸鈉、蔗糖、葡萄糖、尿素、精氨酸、甘氨酸、甘露醇和氯化鈉，以驗證方法的特異性［20-21］。

1.4.2 線性驗證 將Var 參考品進行2 倍系列稀釋，最高稀釋至16 384 倍，采用建立的雙抗體夾心方法進行檢測［20］。以病毒滴度對A （450） 值進行直線回歸分析，選取至少連續6 點對應曲線的R2＞0.95為線性范圍。后對線性范圍內至少6 個濃度在不同時間進行6 個獨立批次的校準曲線的線性驗證。

1.4.3 準確性和精密性驗證 批內回收率與精密度：包被同一批酶標板，將3 份參考品分別稀釋為506 （定量下限）、1 013 （低濃度）、1 520 （中濃度）、2 027 （高濃度） 和2 534 PFU·mL－1（定量上限），每份參考品的每個稀釋度進行4 次重復檢測，同時建立標準曲線和回歸方程計算樣品的病毒滴度，計算批內變異系數（coefficient of variation，CV） 及回收率［20］。批間回收率與精密度：將參考品分為3 塊板、3 d 分別稀釋為上述濃度，每個稀釋度進行8 次重復檢測，同時建立標準曲線和回歸方程回算樣品的病毒滴度，計算CV 和回收率。

2 結 果

2.1檢測方法的優化

2.1.1 捕獲抗體和酶標抗體最優組合 捕獲抗體VZV-mAb-03 和酶標抗體VZV-mAb-HRP-02 的組合P/N 比值為5.9，遠高于其他組合（1.0～2.6），故選用該組合為最優組合，并繼續進行方法的優化和驗證。捕獲抗體和酶標抗體的篩選P/N 比值結果見表1。

表1 捕獲抗體和酶標抗體組合篩選P/N 比值Tab.1 P/N ratios screened by combination of capture antibodies and enzyme-labeled antibodies

2.1.2 捕獲抗體和酶標抗體的最適工作濃度VZV-mAb-03 和VZV-mAb-HRP-02 組合棋盤滴定法確定的A （450） 值見表2，根據結果可確定捕獲抗體VZV-mAb-03 的最適濃度范 圍 為1 ∶2 500～1 ∶7 500，酶標抗體VZV-mAb-HRP-02 的最適濃度范圍為1∶4 000～1∶8 000，二者的稀釋倍數的乘積為2 000 ～3 000 萬。在后續實驗中，取VZVmAb-03 和VZV-mAb-HRP-02 的 稀 釋 度 均 以1∶5 000 為最適濃度。

2.1.3 最適包被條件 在3 種VZV 濃度條件下，Tris-HCl （pH 值為8.7±0.1） 作為包被液的P/N比值均最大， 包被效果最好， 因此選擇Tris-HCl（pH 值為8.7±0.1） 為最適包被液。4 種包被液包被效果的P/N 值見圖1。

4 種包被條件的陰性A （450） 值相差很小，陽性A （450） 值與P/N 比值呈現相同的趨勢，4 ℃過夜包被的P/N 比值最大，確定最適包被條件為4 ℃過夜（18 h）。包被溫度和時間的A （450） 值及P/N 值見表3。

2.1.4 最適封閉條件 不同種類封閉液和相同濃度VZV 條件下，封閉2 h 時陽性A （450） 值約為封閉1 h 時的1.2～1.6 倍，差別較大；而封閉2 h 時陰性A （450） 約為封閉1 h 的0.8～1.1 倍，差別較小， 可 確 定 最 適 封 閉 條 件 為37 ℃、 2 h。 以1%BSA 為封閉劑時P/N 比值最大，為10.32，因此選擇1%BSA 為最適封閉劑。封閉條件和封閉液篩選結果見表4。

表2 VZV-mAb-03 和VZV-mAb-HRP-02 組合棋盤滴定法確定的A（450）值Tab.2 A(450) values identified by checkerboard titration with VZV-mAb-03 and VZV-mAb-HRP-02 （x±s）

圖1 4 種包被液包被效果的P/N 比值Fig.1 P/N ratios of coating effects of 4 kinds of coating solution

2.1.5 最適夾心抗原和酶標抗體反應條件3 種VZV 濃度條件下，以PBST 為樣品稀釋液所對應的P/N 比值均為最高，因此，選擇PBST 為最適樣品稀釋液。3 種樣品稀釋液稀釋VZV 與酶標抗體的P/N 比值見圖2。

表3 包被溫度和時間的A（450）值及P/N 比值Tab.3 A（450）values and P/N ratios of coating temperature and time

隨著反應時間的增加，夾心抗原和酶標抗體的P/N 比值均呈明顯升高趨勢，2 次反應時間分別達到60 min 時，P/N 比值增加至較高水平，且基本穩定。因此，夾心抗原和酶標抗體的最適反應時間均為60 min。當反應溫度為37℃時，夾心抗原與酶標抗體反應時間對應的P/N 比值見圖3。

表4 封閉條件和封閉液篩選結果Tab.4 Screening results of blocking conditions and blocking solutions （x±s）

圖2 3 種樣品稀釋液稀釋VZV 和酶標抗體的P/N 比值Fig.2 P/N ratios of 3 kinds of sample dilutions in diluting VZV and enzyme-labeled antibody

圖3 夾心抗原和酶標抗體的反應時間對應的P/N 比值Fig.3 P/N ratios corresponding to reaction time of sandwich antigen and enzyme-labeled antibody

2.1.6 最適顯色條件 隨著顯色時間的增加，陽性A（450） 值、陰性A （450） 值和P/N 比值均呈升高趨勢，但隨著時間的增加， 相鄰5 min 的陽性A（450） 差值呈遞減趨勢，而陰性A（450）值不斷增加使得P/N 比值變化趨于平緩。 綜合陰性值＜0.1、P/N比值盡可能大這2個條件，顯色時間為10～20 min均符合要求。當顯色15 min 時，陽性A （450） 值接近2.0，陰性A （450） 值小于0.1，且P/N 比值較大，10 min 與15 min 的P/N 比值差值較小，因此，選擇37 ℃、15 min 為最適顯色條件。顯色溫度為37 ℃時不同顯色時間的A （450） 值和P/N 比值見表5。

2.2方法的初步驗證

2.2.1 特異性 選擇Var、 凍干人用狂犬病疫苗（aG 株與PM 株）、LAIV、TIV、DPT、HPV-18型病毒純化液、 HSA、 海藻糖、 谷氨酸鈉、 蔗糖、葡萄糖、尿素、精氨酸、甘氨酸、甘露醇和NaCl進行檢測，檢測結果見圖4 和圖5，可見其他人用疫苗及輔料成分平均A （450） 值均＜0.2，判定為陰性（以陰性值的2.1 倍作為Cut-off 值）。該方法的檢測結果與Var 的稀釋度呈劑量依賴性，而與其他人用疫苗及其輔料成分無交叉反應， 特異性良好。

2.2.2 線性和定量限度 經6 批次重復檢測，抗原病毒滴度在 500～2 600 PFU·mL-1范 圍 內 與A （450） 值呈良好的線性關系，回歸方程分別為Y1=0.000 745 8X+0.362 1、 Y2=0.000 617 0X+0.468 2、 Y3=0.000 525 0X+0.553 7、 Y4=0.000 614 6X+0.459 3、 Y5=0.000 846 4X+0.325 1、 Y6=0.000 473 4X+0.569 3，R2分 別 為0.984 3、 0.974 5、 0.960 1、 0.973 5、 0.959 3 和0.970 8， 均R2＞0.95， 定 量 限 度 為500 PFU·mL-1。見圖6。

2.2.3 準確性和精密性批內回收率與精密度回收率為82.2%～115.7%， 批內CV＜10.2%， 符合定量下限與定量上限的準確性與精密性為75%～125%， 其他校正點的準確性與精密性為80%～120%。見表6。

表5 不同顯色時間的A（450）值和P/N 比值Tab.5 A(450) values and P/N ratios of different color reaction time

圖4 不同病毒疫苗和HSA 的平均A（450）值Fig.4 Average A（450）values of different virus vaccines and HSA

圖5 其他輔料的平均A（450）值Fig.5 Average A（450）values of other ingredients

批間回收率和精密度： 回收率為80.5%～118.6%， 板內CV＜17.4%， 板間CV＜14.9%，符合定量下限與定量上限的準確性與精密性為75%～125%， 其他校正點的準確性與精密性為80%～120%。見表7。

圖6 抗原病毒滴度和A（450）值的線性回歸驗證曲線Fig.6 Linear regression validation curves of antigen virus titer and A (450) values

3 討 論

本方法中捕獲抗體為抗VZV 糖蛋白的單克隆抗體（VZV-mAb-01、 VZV-mAb-02、 VZV-mAb-03、 VZV-mAb-04 和VZV-mAb-05）， 酶標抗體為與其對應的辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體（VZV-mAb-HRP-01、 VZV-mAb-HRP-02 和VZVmAb-HRP-03）， 所 有 抗 體 皆 識 別VZV 表 面 糖 蛋白，通過基因工程構建，在CHO 細胞中表達純化后定量。經過對8 種單抗進行兩兩交叉篩選，得到了1 對對VZV 的特異性極好的夾心抗體—VZVmAb-03 和VZV-mAb-HRP-02，同時確定了最適包被條件、捕獲抗體最適工作濃度、最適封閉條件、最適封閉液、最適樣品稀釋液、酶標抗體最適工作濃度及最適顯色條件，全方位地對該方法進行了優化，使得該方法可快速、有效地檢測VZV 糖蛋白水平。

該方法驗證結果顯示：該方法對VZV 具有良好的特異性，而對疫苗生產過程中需要引入的如凍干保護劑中的小分子、大分子均無交叉反應；將病毒滴度和A （450） 值進行線性回歸， R2＞0.95，可見兩者具有顯著的線性相關性， 線性范圍內（500～2 600 PFU·mL－1） 準確性和精密性良好。

表6 批內準確性和精密性驗證結果Tab.6 In-batch verification results of accuracies and precisions

表7 批間準確性和精密性驗證結果Tab.7 Batch to batch verification results of accuracies and precisions

以標準曲線中間點1 500 PFU·mL－1作為示例進行病毒滴度計算，其回收率允許范圍為80%～120%，則回收濃度為1 200～1 800 PFU·mL－1，此時樣品稀釋倍數約為20 倍， 計算病毒滴度為4.38～4.56 lg PFU·mL－1。 對比VZV 滴定國家參考品標示的病毒滴度為（4.3±0.5） lg PFU·mL－1，其滴度范圍為3.8～4.8 lg PFU·L－1，采用該方法檢測并計算得到的病毒滴度的范圍更精確，這更好地保證了研發過程中數據的準確性。由于ELISA法檢測針對的是病毒表面的糖蛋白水平，不能區分病毒是否具有感染性，相對蝕斑法中檢測的是具有感染性的活病毒的滴度，只采用該方法完全代替蝕斑法可能造成病毒滴度檢測結果偏高的后果。在實際工作中，可將該方法用作中間環節檢測以快速判斷病毒滴度，縮短檢測周期，加快相關研發進程；而在質量放行環節中，可聯合該法與蝕斑法共同檢測， 以確保樣品符合放行標準。 本研究建立的ELISA 檢測方法適合水痘病毒滅活疫苗與基因工程重組疫苗的研究，后續會進一步研究并擴大應用范圍。

綜上所述，該方法的建立可低成本、快速、有效和準確地檢測VZV 糖蛋白水平，為水痘疫苗的生產質控及效價測定方法的替代奠定了基礎。