異葉南洋杉外植體預處理及消毒滅菌的研究

黃松殿 俞建妹 龍敏 劉芳 沈遐

摘 要：采用5%濃度的洗潔精對異葉南洋杉莖段預處理后污染率為80.00%。選用添加PVP藥品0.05g的5%次氯酸鈉溶液消毒滅菌時間12min，污染率為53.33%，但對莖段有一定的損傷作用。始芽誘導最佳時間為春末夏初，從母株基部采取健壯芽，保留鉆形葉接種后分化不定芽時間為26d，始芽生長健康。

關鍵詞：異葉南洋杉;外植體;預處理;消毒滅菌

中圖分類號：S722.3+7

文獻標識碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20201115025

收稿日期：2020-10-10

基金項目：南寧良鳳江國家森林公園“南寧樹木園優質用材樹種科研項目培育與深化”（項目編號：ky2018001）

作者簡介：黃松殿（1966-），男，本科，高級工程師。研究方向：森林培育、植物栽培、植物分類學。

異葉南洋杉（學名：Araucaria heterophylla（Salisb.）Franco）是南洋杉科南洋杉屬植物，喬木，在原產地高可達50m以上[1]。異葉南洋杉樹干通直，樹皮暗灰色，樹冠塔形，樹姿優美，我國廣東、福建、廣西等地均有引種栽培，是南方園林綠化的優良樹種，也是世界著名的公園綠化樹種。其木材紋理美觀，是木質家具貼面的優良用材樹種。異葉南洋杉種子結實率較低，南寧樹木園于20世紀80年代初引種的數十棵異葉南洋杉苗木至今仍未見結實現象。關于異葉南洋杉育苗方面的報道甚少，迄今只查到危孝棋團隊于1989—2004年報道關于異葉南洋杉根接、萌條扦插及根插繁殖技術研究的3篇文章[2-4]，及彭東輝等申請的專利“一種異葉南洋杉水培根誘導與培養技術”[5]，并未見組培方面的報道。異葉南洋杉不定芽小枝的葉排列密集，開展，鉆形，光綠色，向上彎曲，通常兩側扁，具3～4棱，上面具多數氣孔線，易附著微生物，清理難度大，不易獲得無菌體。為此，南寧樹木園于2018年開始立項進行組織培養研究，力爭篩選出異葉南洋杉組織培養適宜的外植體類型，取材時間及其消毒方法，為之后的無性繁殖提供技術支持，為以后規?；嘤齼炠|苗木應用于市場打下堅實的基礎。

1?材料與方法

1.1?材料

試驗材料來源于良鳳江國家森林公園（南寧樹木園）。以三十二年生，胸徑30.0～33.9cm，樹高22.6～25.0m，枝下高5.6～8.8m，樹干通直、寶塔式樹冠的優良單株基部萌芽、樹干不定芽為外植體。試驗時間為2018年8月—2020年9月。

1.2?方法

1.2.1?外植體的預處理對外植體消毒效果的影響

將采回的外植體修剪成4～6cm，在流水中沖洗5～8min后用干凈的棉花擦拭莖段及鉆形葉除去表皮上的灰塵和雜物等，選用洗潔精、洗衣粉、多菌靈5%濃度的溶劑分別浸泡15min，再用流水沖洗30min，后用蒸餾水沖洗6次，轉入超凈工作臺，備用。消毒劑選用0.1%升汞消毒6min，待消毒處理后的外植體均接到始芽誘導培養基上培養，統計污染率。

1.2.2?不同消毒劑組合對外植體消毒效果的影響

將外植體按1.2.1方法預處理后，分別放入不同消毒劑中進行處理，消毒劑組合有：先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒（①）;先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒，滴入3mL吐溫80（②）;先用75%酒精浸泡20～30s，后將外植體用0.1%升汞消毒，添加PVP藥品0.05g（③）;5%次氯酸鈉溶液，滴入600青霉素（④）;5%次氯酸鈉溶液，滴入3mL吐溫80（⑤）;5%次氯酸鈉溶液，添加PVP藥品0.05g（⑥）。

①②③處理的消毒時間分別為3min、6min和9min，④⑤⑥處理的消毒時間分別為8min、10min和12min，不間斷攪拌后再用無菌水沖洗4～6次，每個處理接種30個，3次重復。3～60d后統計污染率及枯死率。

1.2.3?不同外植體取材部位消毒效果的影響

依據植物生長特性，供體植株的外植體取材部位的不同可導致外植體生理狀態上的差異[6]。有研究表明，同一器官的不同部位取下的相同類型組織，其再生能力也不同[7]。本試驗外植體采集分為伐木樹樁萌芽、完整木基部促芽萌芽及樹干節間處促芽萌芽，莖段在進行預處理及消毒處理后接入始芽誘導培養基中，每個處理接種30個，3次重復。3d后觀察，統計污染率與萌芽時間。

1.2.4?不同外植體取材季節對消毒效果的影響

在春季3月、夏季4—6月、秋季7—9月及冬季10—11月連續取材，分別取伐木樹樁萌芽、完整木基部促芽萌芽及樹干結節處促芽萌芽。進行取材季節對外植體萌芽率的影響的比較。每個處理接種30個外植體，3次重復。3d后觀察，統計污染率與萌芽率。

1.2.5?去留外植體鉆形葉對消毒效果的影響

莖段在進行預處理及消毒處理后分為保留鉆形葉及去除鉆形葉2種外植體，分別接入始芽誘導培養基中觀察其感菌及褐化情況。每個處理接種30個外植體，3次重復。3d后觀察，統計污染率及褐化率。

1.3?培養條件

初代誘導培養基為1/2MS加6-BA2.0～5.0mg·L-1加IAA1.0～3.0mg·L-1加CH250mg·L-1，白糖30g·L-1，瓊脂5g·L-1，pH6.0。培養基在1.1MP，121℃高溫高壓條件下滅菌消毒15min。培養室溫度26±2℃，光照時間12～14h·d-1，光照強度800～2000lx。新轉接的培養物，在800lx光照條件下培養7～10d。

1.4?數據分析方法

試驗數據采用Excel 2017、SPSS22.0進行數據統計及顯著性分析，統計污染率、褐化率、萌芽率。

2?結果與分析

2.1?預處理對外植體消毒滅菌效果的影響

從圖1可知，采用洗潔精、洗衣粉為預處理劑對異葉南洋杉莖段處理后，莖段在前3d開始出現污染現象，說明其表面菌類未得到較好清理，在30d內污染情況持續上升趨向穩定，在30～60d仍然有部分莖段存在污染現象，主要表現為內源菌污染;采用多菌靈預處理劑處理后的莖段，表面污染開始時間在3d后，且在30d內污染率相對低，可能原因為多菌靈對莖段表面菌類具有相對較好的殺菌效果，但其對莖段內源菌的消毒效果相對較差，在30～60d期間內源菌污染率近40.00%，總污染率達90.00%。綜上所述，洗潔精對莖段的預處理效果相對較好，接種后60d污染率控制在80.00%。

2.2?不同消毒劑組合對外植體消毒效果的影響

從表1可知，5%次氯酸鈉溶液對異葉南洋杉莖段消毒效果相對較好，污染率低于64.00%，但其對莖段的損傷力較大，莖段枯死率在15.00%以上;為了能較好地降低污染率及枯死率，在消毒劑溶液中添加吐溫80或PVP，一定程度能起到助力消毒及抑制污染的效果;PVP的抑制污染效果相對較好，而在5%次氯酸鈉溶液中添加600青霉素對消毒作用也起到一定的改善作用。

2.3?不同外植體取材部位對消毒及萌芽的影響

從表2可知，完整木樹干節間萌芽污染率相對較低，伐樁萌芽其次，完整木基部萌芽最高，這與植株所處環境相關，取材地位于森林景區，菌類繁多，越接近地面，菌種越繁雜，去除外植體表面菌類難度越大。伐樁萌芽莖段因集聚樹兜及根系的營養供應，粗壯，始芽分化時間快，在第26天開始分化成可視芽，芽尖圓潤飽滿，健康;完整木基部萌芽莖段開始分化成可視芽時間為第45天，芽尖飽滿;完整木樹干節間萌芽莖段開始分化成可視芽時間為第62天，芽尖纖細，偏淡黃。從莖段的始芽分化情況可知，其分化出的新芽跟其莖段內含養分有關，芽分化時間相對較長，原莖段基部形成愈傷時間長不能從培養基中吸取養分，如其體內的養分含量不足易導致不定芽難以分化，抽長生長，莖段易褐化枯死。因此，從母株基部采取健壯芽為外植體利于不定芽分化及抽長生長。

2.4?不同外植體取材季節對消毒效果的影響

從圖2可知，在四季中采集外植體的時間對消毒及不定芽萌芽影響較大，根據自然界的菌類繁衍規律及植株的生物學特性，植株不同時節的抽芽生長結實均需遵循物候期。根據本試驗結果可知，異葉南洋杉進行消毒建立無菌體系的最佳時節為春末夏初，外植體生長點集聚的養分多，分化能力強，利于形成健康的不定芽。秋冬季分化的少量不定芽長勢弱，難以自養，易褐化，難以形成健壯芽苗。

2.5?去留外植體鉆形葉對消毒效果的影響

從試驗結果統計可知，保留外植體鉆形葉的污染率為70.00%，褐化率為13.33%;去除外植體鉆形葉的污染率為46.67%，褐化率為100.00%。異葉南洋杉嫩枝鉆形葉排列密集，保留時難以清理葉腋菌類個體，去除后由于莖段傷口過多既不利于消毒劑處理也不利于接種后傷口愈合，易導致褐化枯死。因此，在進行外植體消毒過程中最好是保留鉆形葉。

3?結論與討論

異葉南洋杉鉆形葉密集，葉腋處易積菌難以清除，用軟毛刷除塵易傷皮，莖段易褐化枯死;用流水沖洗或棉布清洗不易清除邊角灰塵，滋生真菌、細菌，不易獲得無菌體。在試驗中采用5%濃度的洗潔精對異葉南洋杉莖段的預處理效果相對較好，接種后60d污染率控制在80.00%;在消毒過程中選擇5%次氯酸鈉溶液及添加PVP藥品0.05g的消毒劑消毒時間12min，污染率可控制在53.33%內，但對莖段有一定損傷作用。從母株基部采取健壯芽開始分化不定芽時間為第26天，始芽生長健康;始芽誘導時間較長，通常需60d才發生始芽分化，而莖段保鮮時間通常在26～62d逐漸出現褐化現象，難以維持到不定芽分化生長階段。從目前情況來看，為了能獲得較多可應用的外植體，需加大消毒數量，通過增加消毒基數，或在林區時先進行不定芽消毒處理后再進行采集，以獲得更多可用芽。

參考文獻

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志（第7卷）[M].北京：科學出版社，1978：28.

[2]危孝棋，陳正福.異葉南洋杉根接初報[J].福建林學院學報，1989，9（04）：427-428.

[3]危孝棋.異葉南洋杉萌條扦插的初步研究[J].林業勘察設計，1998（01）：59-61.

[4]危孝棋，劉芳，林斌.異葉南洋杉根插繁殖技術研究[J].林業實用技術，2004（06）：10-11.

[5]彭東輝，蘭思仁，吳沙沙，彭鴻俊，周育真，江鳴濤，陳進燎.一種異葉南洋杉水培根誘導與培養技術[P].福建：CN103125356A，2013-06-05.

[6]許益娟.茶樹組織培養再生體系優化與遺傳轉化的研究[D].南京：南京農業大學，2012.

[7]郭勒滾，肖光玉.茶樹組織培養的影響因素及應用展望[J].農業開發與裝備，2015（05）：56.

（責任編輯?李媛媛）