棉籽殼栽培料常壓滅菌生物監測技術及應用*

高春燕，王朝江，李 慧，董文琦，高慶發

（1.河北省農林科學院遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051；2.靈壽縣農業農村局，河北 石家莊 050500）

在食用菌生產時，常壓滅菌被廣泛應用于熟料栽培和栽培菌種制作過程中，是非常關鍵的生產環節，直接關系到栽培的成功與否。對常壓滅菌效果進行檢測的理論方法很多，但由于實用性、可靠性較差且成本高等一些原因限制了其應用。因此目前生產上主要依靠滅菌時間來判定常壓滅菌是否達標，但由于滅菌料量等因素的影響，常導致滅菌不徹底。應用常壓滅菌生物指示劑可以對食用菌生產中棉籽殼栽培料的常壓滅菌效果快速直觀監測，使殺菌效率獲得穩定提升，進而提高栽培食用菌的生物轉化率。

1 棉籽殼常壓滅菌指示菌的獲得

選用含雜菌較多的栽培料，分散到細菌培養基中，并進行不同時長的常壓滅菌處理，篩選出最抗常壓滅菌的殘留菌。

1.1 雜菌含量高的栽培料配方

選用陳舊棉籽殼和麩皮，按照7∶3的比例將棉籽殼與麩皮混合均勻，烘干粉碎。

1.2 制備含雜菌細菌培養基

含雜菌細菌培養基配方：雜菌含量高的栽培料10%、蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、瓊脂粉1.5%。

制作時，用水提取栽培料中的雜菌，水用量為欲制作培養基量的70%，制成雜菌懸液；用剩余30%的水預溶其它組分，將菌懸液加入其它組分混合液中；分裝試管。

1.3 常壓蒸汽滅菌處理含細菌培養基試管

對含細菌培養基試管進行常壓滅菌，處理時間從1 h開始，到14 h結束，按等差時長進行不同時長的滅菌處理，最大時長為殺死全部雜菌所需的時間。

1.4 室溫下恢復培養殘留菌

1.5 揀出最抗常壓滅菌的殘留菌

揀出達到完全殺菌狀態前最后出的單孢菌落，此菌即為最耐常壓滅菌的殘留菌。將該菌轉接到細菌培養基斜面試管上，培養留存。

1.6 檢驗殘留菌在棉籽殼栽培料上的生長能力

將殘留菌轉接到經高壓滅菌的純棉籽殼培養基上，20℃～24℃溫度下培養。該菌在24 h～36 h內能形成明顯大片菌落。表示該菌能在環境溫度（20℃～35℃）下，在棉籽殼培養基上正常生長。

該殘留菌經中國農業微生物菌種保藏管理中心鑒定為枯草芽孢桿菌。

2 指示菌常壓蒸汽滅菌效果的能力檢驗

將殘留菌制成麩皮菌劑，把麩皮菌劑和棉籽殼栽培料轉接于細菌培養基上，進行常壓滅菌，比較二者對常壓滅菌的抗力大小。

2.1 制備殘留菌麩皮菌劑

麩皮菌劑配方：麩皮、豆粉、磷酸氫二鉀、水的配比為 500∶100∶1∶440，混合均勻，121℃滅菌 2 h，接入殘留菌。經培養、冷卻、干燥、營養細胞滅活等過程，最后烘干至恒重，制成殘留菌麩皮菌劑。用平板計數法，把殘留菌麩皮菌劑的殘留菌芽孢數控制在106個/g。

2.2 檢驗指示菌常壓蒸汽滅菌效果能力

2.2.1 檢驗用細菌培養基

配方：蛋白胨1.0%、酵母浸粉0.5%、氯化鈉0.5%、磷酸氫二鉀0.2%、瓊脂粉1.5%，制成斜面試管備用。

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2.2.2 檢驗過程

將0.23 g的殘留菌麩皮菌劑和棉籽殼栽培料分別裝入制備好的斜面試管中。

對上述試管進行100℃常壓滅菌，滅菌時長分別為 1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h，滅菌后直接擺放斜面20℃～24℃培養，觀察細菌恢復生長情況。

棉籽殼栽培料滅菌3 h或4 h時已無菌長出，麩皮菌劑滅菌7 h或8 h時仍有菌長出，表明殘留菌比栽培料雜菌更具有抗常壓蒸汽滅菌的能力，即殘留菌被殺死時，栽培料中雜菌早已被殺死。證明其具有指示滅菌效果的能力。

3 棉籽殼常壓滅菌指示劑的制作

棉籽殼栽培料常壓滅菌生物指示劑由芽孢麩皮菌劑和用于指示菌恢復生長的干培養基（無菌）組合而成，分裝在100 mL玻璃瓶內，裝入后密封。1個玻璃瓶即為1個指示劑。

3.1 繁殖指示菌

培養斜面試管菌種，所用斜面試管培養基為細菌培養基，劃線接種，36℃下培養48 h，獲得指示菌；將獲得的指示菌制成芽孢麩皮菌劑，方法參見2.1，將芽孢濃度調整為109cfu·g-1。

3.2 配制干粉培養基

1個（瓶） 指示劑中干粉培養基按40 mL計，各種材料的重量為蛋白胨0.40 g、酵母浸粉0.20 g、瓊脂粉0.80 g、葡萄糖0.20 g，氯化鈉0.32 g、磷酸氫二鉀0.08 g。

3.3 組配封裝

將1個（瓶） 指示劑干粉培養基和0.23 g芽孢麩皮菌劑（干培養基加水后，芽孢濃度106個/mL，無菌保證水平為10-6），放入玻璃瓶內，丁基膠塞、鋁蓋封口即制成1個（瓶）指示劑。

4 棉籽殼常壓滅菌指示劑的應用

棉籽殼常壓滅菌指示劑與栽培料袋同時滅菌，滅菌后對指示劑瓶恢復培養，根據指示菌生長情況，判定常壓滅菌效果。

4.1 指示劑瓶內注水

滅菌前，用一次性注射器往指示瓶內注入40 mL自來水、蒸餾水、礦泉水或井水均可，搖晃均勻。

4.2 指示瓶與栽培料同時滅菌

將指示劑瓶裝入將要滅菌的料袋中間位置，或者擠在料袋中間，含指示劑瓶的料袋或指示劑瓶應放在距蒸汽管道出口較遠、位置低、蒸汽最不宜達到的地方，并和栽培料袋一同滅菌。1 t栽培料（干重）建議用2個～3個指示瓶。

4.3 指示瓶培養

滅菌結束后，將指示劑瓶趁熱放置在自然環境下溫度最高（培養溫度20℃～40℃） 且遮陰的地方培養。若出鍋時瓶內培養基已經凝固，擺放時則隨凝固的形狀擺放，使凝固的培養基平面朝上擺放；此時若瓶內培養基還未凝固，需將瓶臥放使其凝固。

4.4 滅菌效果判定

指示劑瓶培養2 d～3 d后，若培養基表面出現大面積近白色不透明的菌落，表明該批次料滅菌不達標；若培養基表面出現單個白色或近白色不透明的菌落，表明該批次料滅菌基本達標；若不出現菌落，表示滅菌達標。對滅菌不達標的栽培料，如已接種應加強通風管理，特別是降低發菌溫度，防止雜菌爆發產生危害；未接種的建議重新滅菌；對基本達標的栽培料，也應加強通風管理，降低發菌溫度，防止雜菌過快恢復生長。另一方面，再滅菌時，應延長滅菌時間，降低料袋排列緊密程度，增加火力。

經檢測玉米芯中的最耐熱菌抗熱能力略低于棉籽殼，因此本指示劑也適用于玉米芯為栽培主料的食用菌常壓滅菌效果監測。本指示技術也可在高壓滅菌時應用。