菠蘿皮渣中醋酸菌的分離與篩選

宋 曦，汪 慧，王應強，張亞亞

（隴東學院農林科技學院，甘肅慶陽 745000）

0 引言

果醋是以水果為原料，經酒精、醋酸發酵后形成的一種發酵飲品[1]。果醋有增進食欲、促進消化、降低血膽固醇、預防動脈粥樣硬化和心腦血管疾病等功效，兼具果蔬的營養功能，富含多種維生素、礦物質，使果醋成為了備受青睞的功能型飲品[2-3]。

在果醋發酵過程中，醋酸菌的性能對產品品質有較大的影響，而具有優良發酵性能的耐醇、耐酸菌株選育也成為果醋生產中新的研究熱點[4-6]。野生醋酸菌來源廣泛，自然界中土壤、水果、空氣中均可分離獲得。符楨華[7]研究了用菠蘿棄渣自然發酵醋酸菌。尚云青[8]以菠蘿皮渣為原料，分別添加AS1.41和滬釀1.01 醋酸菌制作果醋，滬釀1.01 產醋酸性能較好。國內從菠蘿皮渣中分離醋酸菌并應用到果醋發酵中的研究較少，多使用商品用菌株，主要原因為野生菌株發酵性能較差。菠蘿在消費過程中產生大量棄渣，經自然放置一段時間后可富集周圍環境中的醋酸菌，從中分離篩選醋酸菌，以期獲得能夠應用于果醋發酵工業的性能優良的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

菠蘿皮渣（市售，產地：海南）.

1.1.2 主要試劑

葡萄糖、酵母膏、甘油、乙醇95%、CaCO3、酚酞指示劑（0.5%）、（NH4）2SO4、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、乙酸鈣、乳酸鈣、濃硫酸、瓊脂、斐林試劑、溴酚藍水溶液（0.04%）、FeCl3、草酸銨、結晶紫染液、碘液、番紅染液、碘化鉀、0.1 mol/L NaOH溶液。

1.1.3 儀器和設備

JJ-200 型電子天平、YXQ-LS-40S11 型立式蒸汽壓力滅菌器、SPA-150B 型生化培養箱、XSP-2CA型生物顯微鏡、 BCD-206STPH 型海爾冰箱、JB-HS-1300U 型潔凈工作臺、離心機、恒溫振蕩培養箱、分光光度計等。

1.1.4 培養基[9]

（1） 基礎發酵培養基。酵母膏1%，葡萄糖1%，pH 值4.5，于121 ℃下滅菌20 min 后備用，使用前添加4%Vol 無水乙醇。

（2） 碳酸鈣平板分離培養基。基礎發酵培養基中加入瓊脂2%，CaCO32%，于121 ℃下滅菌20 min，待溫度冷卻至55 ℃后加入無水乙醇3%Vol，搖勻傾倒于無菌培養皿中。

（3） 醋酸菌斜面保藏培養基。酵母膏1%，葡萄糖1%，瓊脂2%，KH2PO40.05%，MgSO40.05%，分裝于試管中，于121 ℃下滅菌20 min，溫度冷卻至55 ℃后加入無水乙醇3%Vol，擺成斜面即可。

（4） 生理生化鑒定培養基。Horyer-Frateur 培養基、GYC（葡萄糖- 酵母膏- 碳酸鈣） 培養基生酮培養基、產5- 酮基葡萄糖酸鹽試驗培養基、產葡萄糖酸試驗培養基、乙酸氧化試驗培養基、乳酸氧化試驗培養基、氧化乙醇試驗培養基、葡萄糖發酵培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 醋酸菌分離篩選流程

原材料→增殖培養→菌種分離→革蘭氏染色→產醋酸定性試驗→菌株初篩→菌種復篩→生理生化試驗。

1.2.2 增殖培養

菠蘿皮渣在室溫下放置1 周自然發酵，稱取10 g自然發酵液，置入盛有100 mL 基礎培養基的三角瓶中，于32 ℃下以轉速150 r/min 振蕩培養72 h。

1.2.3 樣品稀釋培養

取1 mL 增殖培養液置于99 mL 無菌生理鹽水的三角瓶中，然后吸取1 mL 稀釋液到9 mL 無菌生理鹽水的試管中，依次梯度稀釋，獲得最終含量為1×10-4，1×10-5，1×10-6，1×10-7，1×10-8的稀釋液。用移液槍準確吸取各梯度稀釋液1 mL 于無菌培養皿中，并傾注CaCO3平板分離培養基，于32 ℃恒溫培養箱中培養72 h，挑選菌落形態一致、有透明圈的單菌落。

1.2.4 菌種純化

挑取以上培養的目的單菌落，在CaCO3平板分離培養基上多次劃線分離純化，并接種于斜面保藏培養基上。

1.2.5 菌株的初篩[10]

對分離菌株所產透明圈直徑進行比較。然后從分離培養基上挑取菌落形態一致、H/C 值（透明圈直徑與菌落直徑的比值） 較大的單菌落，進行下一步研究。

1.2.6 革蘭氏染色

將初篩得到的菌株進行革蘭氏染色并鏡檢。

1.2.7 產醋酸定性試驗

參考杜連祥[11]的方法。

1.2.8 菌種復篩

將初篩得到的菌種接種于產酸發酵培養基中，每株菌做3 個平行，在32 ℃下以轉速150 r/min 恒溫振蕩培養72 h，產酸量高的菌株為復篩得到的菌株。

1.2.9 生理生化試驗[12-14]

接觸酶的試驗、GYC 培養基產色素試驗、單一氮源生長試驗、產5- 酮基葡萄糖酸鹽試驗、產葡萄糖酸試驗、產纖維素試驗、氧化乙酸能力試驗、氧化乳酸的試驗、氧化乙醇試驗、甘油生酮試驗、發酵葡萄糖試驗。

1.2.10 產醋酸量的測定

參考姜曉芝等人[15]的方法。

1.2.11 產醋酸量隨時間變化曲線

將醋酸菌接種于50 mL 發酵培養基中，于32 ℃下以轉速150 r/min 恒溫振蕩培養，分別在發酵12，24，36，48，60，72，84，96，108，120 h 測定各菌的產醋酸量，做3 個平行，繪制各菌株的產醋酸量隨時間變化曲線。

1.2.12 醋酸菌生長量的測定

將醋酸菌接種于50 mL 發酵培養基中，于32 ℃下以轉速150 r/min 的恒溫振蕩培養，培養12 h 后，分別在13，14，15，16，17，18，19，20，21，22 h測定菌種的生長情況，做3 個平行，繪制生長曲線。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩

從菠蘿殘渣中分離醋酸菌，選取在CaCO3分離平板培養基上有透明圈的菌株作為研究對象，共得到4 株菌，分別標記為B1，B2，B3，B4，對以上4 株菌分別進行革蘭氏染色，B1為革蘭氏陽性桿菌；B2，B3，B4為革蘭氏陰性桿菌；將3 株革蘭氏陰性桿菌分離純化，保藏于斜面試管。

2.2 產醋酸定性試驗結果

對接種B2，B3，B4菌種的發酵液進行產酸定性試驗，在發酵液中加入5%FeCl3溶液后，3 個菌種發酵液中均有紅褐色沉淀產生。

產醋酸定性試驗結果見圖1。

由圖1 可知，初篩得到的3 株微生物經恒溫振蕩培養后均能產生一定量的醋酸，醋酸與FeCl3結合，形成紅褐色沉淀。結合革蘭氏染色試驗結果，確定初篩分離到的細菌為產醋酸細菌，具體菌屬可根據生理生化鑒定結果判定。

2.3 菌種復篩

將初篩得到的3 株菌分別進行發酵試驗，在發酵72 h 后測定發酵液中醋酸含量，結果為B2菌種在發酵72 h 時產醋酸量僅為0.37 g/100 mL，B3產醋酸酸量為0.9 g/100 mL，B4產醋酸量為0.83 g/100 mL。說明B2發酵產醋酸能力較弱，B3，B4產醋酸能力較強，可達到B2產醋酸量的2 倍以上。根據初篩得到微生物產醋酸能力，B3，B4相對產醋酸量高，將其作為進一步研究對象。

2.4 生理生化試驗結果

對B3，B4分別進行生理生化試驗。

B3，B4部分生理生化鑒定結果見表1。

生理生化鑒定結果表明，復篩得到的2 株產醋酸細菌性能基本相同，僅GYG 培養產色素試驗結果有差別，B3試驗結果為陽性，B4試驗結果為陰性；在甘油生酮試驗中，2 株細菌均產生沉淀，但B3試驗產生的沉淀較多，B4試驗產生的沉淀較少；其他生理生化試驗結果基本相同。

表1 B3，B4 部分生理生化鑒定結果

B3，B42 株菌在革蘭氏染色后觀察到其細胞形狀均為桿狀，無球桿狀，革蘭氏陰性，且在培養基上不產生水溶性色素，菌苔光滑，發酵葡萄糖試驗為陰性，在pH 值為4.5 的液體培養基中可以生長，并可氧化乙酸產生CO2，通過菌種形態和生理生化試驗結果，察看《常見細菌鑒定手冊》可確定分離得到的產酸細菌為醋酸桿菌屬，該結論與前期產醋酸定性試驗結果相符，對其發酵過程中產醋酸量進行測定，以確定其在有氧發酵條件下產醋酸的最佳發酵時間。

2.5 產醋酸量試驗結果

將B3和B4在相同條件下恒溫振蕩培養，對培養過程中產醋酸量進行測定。

B3，B4產醋酸量隨時間變化圖見圖2。

隨著培養時間的增加，分離菌株產醋酸量先升高后降低，B3，B4菌株產醋酸量在32 ℃培養84 h 達到最高，產醋酸量分別為1.12 g/100 mL 和1.2 g/100 mL；84 h 后2 株菌的產醋酸量均大幅降低，B3產酸量降低38.4%，B4產醋酸量降低41.7%；菌株之間產醋酸量差異較小，在84 h 時B4產醋酸量比B3僅高0.08 g/100 mL。于32 ℃下以轉速150 r/min 恒溫振蕩培養B3產醋酸量差異顯著（p＜0.05），B4產醋酸量差異極顯著（p＜0.01）。可見B3，B4菌株在溫度32 ℃，轉速150 r/min 的發酵條件下，培養84 h 達到產酸量高峰。微生物發酵過程中多種因素影響其產物產量，對于好氧菌株而言主要為發酵的溫度和需氧量，種子的種齡、培養基的成分對其也有影響。研究中對復篩菌株在醋酸菌一般發酵條件下培養，之后可優化其發酵條件和發酵培養基，提高菌株產醋酸量。

2.6 菌株的生長曲線

B3，B4菌株生長曲線見圖3。

根據OD 值結果繪制B3，B4菌株的生長曲線，可判定菌株B3的對數生長期為培養12～17 h，之后生長緩慢開始衰亡，在17 h 時OD600值達到0.37；菌株B4的對數生長期為培養12～20 h，之后迅速進入衰亡期，在19h 時OD600值達到0.36；菌株B3在溫度32 ℃，轉速150 r/min 的恒溫振蕩培養中生長曲線結果差異顯著（p＜0.05），B4生長曲線結果差異極顯著（p＜0.01）。采用培養基濁度測定微生物生長曲線方法較為簡便，在測定后期結果可能出現誤差，這是因為隨著微生物培養時間的延長，一部分微生物在培養過程中衰亡、細胞裂解，且有起酵現象，導致培養基濃度增加，也就是從培養21 h 后生長曲線有增長現象[16]。在具體生產過程中，可采用平板計數法，能更準確地測定培養液中微生物活細胞數量。

3 結論

菠蘿果肉營養價值豐富，菠蘿棄渣作為菠蘿產業的下腳料，合理利用既可以降低生產成本，又可以減少環境污染[17-18]。從自然腐敗的菠蘿中分離到醋酸菌，經初篩、產醋酸定性試驗、復篩共得到2 株醋酸細菌，分別標記為B3，B4。對分離的菌株進行生理生化鑒定，確定其為醋酸桿菌屬，對其發酵性能進行研究表明，B3，B4菌株產醋酸量于溫度32 ℃，于轉速150 r/min 下恒溫振蕩培養84 h 達到最高值，產醋酸量分別為1.12 g/100 mL 和1.2 g/100 mL；由生長曲線可判定菌株B3的對數生長期為培養12～17 h，菌株B4的對數生長期為培養12～20 h，之后迅速進入衰亡期。對已篩選的菌株后期可通過發酵條件優化和誘變育種提高其發酵能力，并應用到實際果醋生產中。