川芎嗪對缺氧狀態下視網膜血管舒縮因子表達影響的實驗研究*

吳沂旎，吳寧玲， 莊曾淵

1.陜西省中醫醫院(西安 710003)；2.中國中醫科學院眼科醫院(北京 100040)

川芎嗪被廣泛應用于視網膜、視神經缺血性疾病的治療，藥理研究發現川芎嗪是從川芎根莖中分離出的生物堿單體，又名四甲基吡嗪，可抵抗交感神經的血管收縮、促進血液循環、抑制血小板聚集反應、阻抑血栓形成，調節各種血管活性物質的釋放[1]。然而，對于缺血性眼底病的作用機理尚未明確，目前欠缺合理用藥的依據。近幾年大量研究證實，因各種原因導致的眼底缺血性疾病與眼底視網膜、脈絡膜血管內皮細胞受損及其血管相關活性因子失調相關[2]。因而，研究保護眼底血管內皮細胞作用機理，預防其功能損傷是預防這類疾病優選方案。本實驗目的在于通過觀察川芎嗪對缺氧狀態下視網膜血管內皮細胞(Retinal vascular endothelial cell，RVEC)血管舒縮因子的作用，進而為不同的缺血性眼底病變提供實驗及理論根據。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗試劑：DMEM培養基(美國GIBCO公司)、胎牛血清(四季青公司)、生長因子(中日友好醫院細胞實驗室)、鹽酸川芎嗪注射液(規格：40 mg，鄭州卓峰制藥有限公司)、牛視網膜血管內皮原代細胞(購于北京中日友好醫院細胞庫)、谷氨酰胺、雙抗、肝素(上海西唐生物科技有限公司)、內皮型一氧化氮合酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS)兔抗人多克隆抗體(Abcam公司)、內皮素-1(ET-1，Endothelin-1)、兔抗人多克隆抗體(Acris生物技術公司)。

1.2 儀器與設備：倒置顯微鏡(日本Olympus公司)、ELX808 酶標儀(美國Bio-Tek公司)、伯樂電泳儀、轉膜儀(美國Bio-RAD公司)、勻漿器(型號：PRO200，美國PRO公司)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養：將牛視網膜血管內皮原代細胞復蘇，從液氮中取出細胞凍存管，直接浸入37 ℃水浴鍋中，快速震搖使其預熱解凍，將解凍后的細胞懸濁液移入離心管中，轉速1000 r/min，常溫下離心5 min，棄去上清液，加入DMEM完全培養液[含200 g/L FBS、100 mg/L內皮細胞生長添加劑(Endothelial cellgrowth supplemen，tECGS)、100 mg/L肝素以及1 g/L雙抗]，靜置后移入明膠包被的培養瓶。置于5%的CO2，37 ℃的培養箱中。次日待細胞貼壁后更換培養液。觀察貼壁細胞生長至80%融合度便可傳代1次，選取第6代細胞進行分組實驗。

2.2 實驗分組：選取長勢較好，貼壁達80%的細胞，按1∶3比例傳代培養。待48 h細胞貼壁生長，呈梭形或扁平形，細胞緊密連接，呈鵝卵石樣鑲嵌排列時，加入PBS溶解的 CoCl2100 μmol/L進行缺氧誘導培養12 h；隨機分為三組。缺氧對照組:不含藥物、無生長因子及血清的培養液組。川芎嗪0.02 μg/ml組：缺氧組+含終濃度為0.02 μg/ml川芎嗪的培養基。川芎嗪0.2 μg/ml組：缺氧組+含終濃度為0.2 μg/ml川芎嗪的培養基。

2.3 MTT法檢測各組的吸光度值：收取分組好的細胞懸濁液，將密度調至2×105個/ml，種于96孔板上,每孔200 μl,培養24 h后，每孔加入20 μl MTT，培育4 h后,棄去上清液及培養基,每孔加入二甲亞砜150 μl,在搖床上震蕩8 min打勻,待藍色結晶充分溶解,用自動酶標儀 (波長562 nm) 測定各孔光吸光度A值。實驗重復測量4次。

2.4 Western blot法檢測各組RVEC內eNOS、 ET-1蛋白的表達：取分組收集的細胞分別移入1、2、3號離心管內，并加入100 μl裂解液，將離心管放入冰盒內孵育20 min，12000 r/min離心，20 min后提取上清液，分裝。將做好標記的96孔板內分別加入稀釋好的1～3號 BCA標準品和待測蛋白樣品各25 μl，每孔加入200 μl BCA工作液，充分混勻后至37 ℃孵育30 min，冷卻后用酶標儀測定562 nm處的吸光度值，計算樣品中的蛋白濃度。在收集蛋白樣品中加入適量濃縮的SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，放入沸水中加熱5 min，冷卻后，3000 r/min，30 s后離心備用。將SDS聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質電泳轉移到硝酸纖維素膜上，放入封閉液內封閉1 h。將膜放入一抗( NOS 1∶100，ET-1 1∶1500)內，4 ℃孵育過夜。TBST液洗10 min，4遍，按(1∶10000)稀釋二抗，把膜放入二抗內，孵育50 min。TBST液沖洗6次，ECL試劑顯色曝光，沖洗顯示條帶，電泳條帶密度值以灰度值表示，并以β-actin作為內參照。信號強度用IMAGEJ圖像分析軟件進行定量分析。

結 果

1 各組細胞生長狀態 本實驗細胞傳代培養，細胞長勢良好，細胞貼壁生長1 d后，呈梭形或扁平形，細胞透亮，活性良好，細胞緊密連接，呈鵝卵石樣鑲嵌排列；加入CoCl2100 μmol/L進行缺氧誘導，細胞數量明顯減少，缺氧在多方面造成血管內皮細胞的損傷，生長受到抑制，可見細胞膜受損，細胞排列密度降低，部分細胞脫落甚至凋亡，造模成功；在缺氧受損的細胞中分別加入川芎嗪濃度為0.02、0.2 μg/ml的藥液，細胞密度逐漸增高,凋亡細胞明顯減少,細胞排列較缺氧組密集(圖1)。

2 MTT法檢測各組細胞增殖情況 缺氧對照組及川芎嗪各組的吸光度值均較正常細胞組低，差異有統計學意義(P<0.01)。川芎嗪0.02 μg/ml組、0.2 μg/ml組細胞的吸光度值明顯高于缺氧對照組 (P<0.01)，且川芎嗪0.2 μg/ml組的吸光度值高于川芎嗪0.02 μg/ml組(P<0.01)，即與濃度呈正相關性。見表1。

A：正常細胞組；B：缺氧對照組；C：川芎嗪0.02 μg/ml組；D：川芎嗪0.2 μg/ml組

表1 MTT法檢測各組在缺氧狀態下RVEC增殖情況比較

3 各組eNOS、ET-1蛋白表達結果 采用LSD方法進行比較。與缺氧對照組相比，川芎嗪0.02 μg/ml組及0.2 μg/ml組的eNOS蛋白表達均升高，差異有統計學意義(P<0.01)，且川芎嗪濃度與蛋白表達呈正相關；兩組川芎嗪組間比較，差異有統計學意義(P<0.01)。與缺氧對照組相比，川芎嗪0.02 μg/ml組及川芎嗪0.2 μg/ml組的ET-1蛋白表達均下降，各組間比較差異有統計學意義(P<0.01)，但兩組川芎嗪組間ET-1蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2(圖2)。

表2 各組eNOS、ET-1蛋白表達及平均灰度值比較

1：缺氧對照組；2：川芎嗪0.02 μg/ml 組；3：川芎嗪0.2 μg/ml 組

討 論

川芎味辛、溫，入肝膽、心包經。川芎嗪是川芎根莖中分離的有效成分，屬吡嗪類生物堿。川芎嗪具有抗凝、抗血栓形成、擴張血管、降低血黏度、改善微循環等作用。眼科領域中川芎嗪對視網膜缺血再灌注損傷具有保護作用，主要通過減少細胞凋亡、抗氧化自由基作用、改善血液流變作用、Ca2+離子通道阻滯劑的作用來實現[3]。因此，川芎嗪被廣泛應用于閉塞性血管疾病、缺血性心腦血管疾病。此外，還有研究發現川芎嗪能阻抑非酶糖化終末產物的形成，降低視網膜組織中血管內皮生長因子過度表達，從而防止新生血管不斷生成，改善眼底血管組織缺血缺氧狀態[4]。目前已經有川芎嗪對牛肺動脈內皮細胞、人臍靜脈內皮細胞保護作用的研究[5]，但對視網膜血管內皮細胞的作用研究甚少。鄧新國等[6]通過腹腔靜脈注射鹽酸川芎嗪實驗檢測分析兔眼視網膜組織的藥代動力學，該實驗證明川芎嗪能夠滲入血視網膜屏障進入眼底視網膜，該結論為川芎嗪能全身用藥治療視網膜血管病變及眼底缺血性疾病提供了理論依據。

血管內皮細胞作為血液與血管平滑肌細胞之間的機械屏障，是人體最重要的內分泌器官[7]，容易受到體內外各種致病因素損傷，損傷后其分泌活性物質之間的平衡被打破，從而引起血管功能系統障礙[8]。血管內皮細胞主要分泌兩種活性物質：舒血管物質，如NO、前列環素、內皮源性舒張因子等；縮血管物質，如內皮素、血管緊張素Ⅱ、內皮細胞收縮因子等。其中NO和ET-1是反映血管內皮細胞受損程度最可靠、最直接的標志[9]。生理情況下ET-1具有內皮細胞最強的收縮作用，可使血管收縮、管腔狹窄、血流緩慢、外周阻力增加；而NO可抑制血管內皮素的分泌，舒張血管，增加局部血流，抑制血小板的活化和凝集[10]。二者作為平衡使者，維持著血流量的相對穩定和血管床的靜息舒縮狀態。缺氧環境下可引起視網膜血管多方面病理變化，如新生血管形成、血管滲透性增加、視網膜神經節細胞損傷最終引起視覺功能喪失等。缺氧在多方面造成血管內皮細胞的損傷[11]。此時一氧化氮含量減少、ET-1釋放增多，二者平衡失調，致使血管舒縮功能紊亂，促使眼底視網膜病變的發展。

NO作為內皮源性舒張因子,具有擴張血管和調節內皮細胞功能的作用，由限速酶NOS催化L-精氨酸脫胍基生成。NOS有三種亞型，其中eNOS分布于血管內皮細胞，它產生的NO更接近血管平滑肌，可以激活血管平滑肌中的可溶性鳥苷酸環化酶，使胞內cAMP濃度升高，從而起到擴張血管、抑制血小板凝集作用[12]。eNOS活力水平直接影響NO的合成。NO為小分子氣體物質不易檢測，我們通過檢測NO合成的eNOS，間接檢測NO的表達[13]。本研究中川芎嗪各藥物組血管內皮細胞eNOS的表達均升高，與缺氧對照組比較有統計學差異，且隨著藥物濃度增加蛋白含量增加；說明川芎嗪通過增強eNOS的活性來促進NO的分泌合成，從而擴張血管、抑制血小板凝集。在本實驗中，川芎嗪能顯著上調 eNOS的表達，可以推斷川芎嗪逆轉缺氧狀態下視網膜血管內皮細胞的損傷，其部分機制是通過上調eNOS的表達，從而增加內皮血管產生NO介導的。

ET是一種內源性長效血管收縮因子，用來調節血管緊張性及局部血液循環的縮血管活性肽。ET具有4種異構體。其中縮血管作用最強的是ET-1[14]。在心臟和血管上有豐富的ET-1受體，ET-1與組織中相應受體結合，激活第二信息cGMP，繼發三磷酸肌醇水平增高，誘導細胞內Ca2+增高，使Ca2+內流，血管收縮。最終導致組織缺血、缺氧，自由基產生，導致細胞的凋亡和壞死。視網膜血管內皮細胞受損是缺血性視網膜病變的一個突出特點。近年來研究報道糖尿病患者血漿中ET-1呈現高濃度狀態，正常眼壓性青光眼患者血漿ET-1水平較健康對照組明顯升高。視神經炎、視網膜靜脈阻塞、球后視神經炎等缺血性眼病患者血漿ET-1水平升高[15]。本實驗結果顯示：川芎嗪能顯著降低ET-1蛋白的表達，與對照組相比差異有統計學意義，且呈濃度負相關性，與前期臨床實驗一致；說明川芎嗪可抑制缺氧狀態下視網膜血管內皮細胞分泌ET-1，減輕血管收縮，從而改善眼部缺血病理狀態，減輕細胞損傷。

我們在本實驗中發現川芎嗪可以改善缺氧狀態下視網膜血管內皮細胞的活性，對細胞的增殖有一定促增長作用。本實驗研究表明川芎嗪組能促進視網膜血管內皮細胞分泌eNOS、減少ET-1生成，并呈現濃度依賴關系。說明川芎嗪能通過上調NO抑制血管內皮素的分泌，舒張血管增加局部血流；同時抑制ET-1的分泌減輕血管收縮，減少外周阻力；從而維持血管內皮細胞舒縮血管物質的動態平衡。可以推測因缺血缺氧導致血管內皮細胞損傷從而引起嚴重的眼底病變，川芎嗪可在一定程度上阻斷內皮細胞受損導致的部分病理變化，從而減輕小血管痙攣，增加視網膜血液供應，改善患者視功能，可望為治療這類眼部疾病提供新的實驗依據。