清熱潤燥方對哮喘小鼠氣道反應及炎性反應影響的實驗研究*

趙 茜，吳佳麗，余文麗，魏丹霞

1.云南中醫藥大學第三附屬醫院(昆明 650011)；2.昆明市中醫醫院(昆明 650011)

支氣管哮喘在中醫屬“哮病”范疇[1]，近年來哮喘患病率在全球范圍內有逐年增長的趨勢，2019年一項調查顯示，目前我國成人哮喘患者總數已達到4570萬[2]。中醫認為哮病的發生是由于宿痰伏肺，若誘因或感邪引觸致痰阻氣道，肺失肅降、痰氣搏結便產生發作性痰鳴氣喘疾患。既然引起哮病的根本原因是宿痰，那么運用培土生金以“潤養”、通調津氣以“通利”[3]不失為治療哮病的方法，“清熱潤燥口服液”[4]是名中醫陸家龍老師的經驗方，通過現代工藝制備而成，其作用機理是通過增加肺組織或者氣道的水液生成，以“潤”養氣道，通過減少氣道病理性黏液分泌，以“通利”氣道、促痰液排出來治療哮喘。本實驗基于以上理論，通過觀察該藥對哮喘模型小鼠的氣道炎癥以及慢性氣道炎癥中最主要的黏蛋白5AC(Mucin 5AC，MUC5AC)，以及肺組織中影響氣道水液代謝的水通道蛋白5(Aquaporin 5，AQP5)的影響，并根據結果探討基于“潤養與通利”理論，治療哮喘的實驗基礎。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：72只6～8周齡BALB/c小鼠，平均體重(20±2)g，由昆明醫科大學實驗動物學部提供[許可證號：SCXK(滇)k2015-0002]。

1.2 實驗藥物：清熱潤燥口服液由桑葉、浙貝母、麥冬、茯苓、半夏各200 g，苦杏仁120 g，炒谷芽、炒麥芽、蘆根、薏苡仁、冬瓜仁各300 g，陳皮60 g，南沙參240 g組成。委托云南中醫藥大學第三附屬醫院制劑室制備提供，4.1 g原生藥/ml。藥物保存于4～8 ℃冰箱中備用，使用前復溫至20～25 ℃使用。

2 實驗方法

2.1 動物模型建立：每組12只小鼠，除對照組外，各組小鼠于第1、8、15 天腹腔注射OVA致敏液0.2 ml(含0.2 mg OVA和1 mg氫氧化鋁)。于第21 天起，將小鼠置于透明容器內，給予2% OVA的生理鹽水霧化激發，1次/d，30 min/次，連續7 d；正常組采用生理鹽水代替OVA進行處理。模型組造模后死亡2只，清熱潤燥低劑量組死亡1只。

2.2 動物分組及給藥：72只6～8周齡BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥物對照組(地塞米松)及清熱潤燥高、中、低劑量組，每組12只小鼠雌、雄各半。每組給藥劑量的依據：根據相關標準[5]并結合前期實驗結果，正常組與模型組于每日OVA霧化攻擊前1天，按照給藥劑量同體積的生理鹽水進行灌胃，清熱潤燥高劑量組在造模成功后以8.64 g/(kg·d)劑量進行灌胃，清熱潤燥中劑量組在造模成功后以4.32 g/(kg·d)劑量進行灌胃，清熱潤燥低劑量組在造模成功后以2.16 g/(kg·d)劑量進行灌胃，陽性藥物對照組在造模成功后以給藥劑量同體積的地塞米松進行灌胃。

2.3 實驗檢測指標：氣道反應性的測定：灌胃結束后第2天，小動物生理儀記錄小鼠的呼吸頻率和潮氣量。肺組織病理學檢測：HE染色，普通光學顯微鏡下觀察顯色結果并拍照。氣道杯狀細胞的檢測：PAS染色觀察各組間小鼠肺氣道杯狀細胞的分布及數量變化。小鼠肺泡灌洗液中MUC5AC、AQP5、IL-13的檢測：小鼠飼養第30 天，禁食12 h后予10 %水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔內注射麻醉，腹主動脈取血后放血處死小鼠，開胸，暴露氣管及肺。用套管針插入左主支氣管并結扎、固定，拔出針芯后用2 ml冰生理鹽水灌洗左肺，再緩慢回抽，每次回抽液體約1.5 ml，如此反復灌洗3次，回收率約75%。將回收的灌洗液混勻，先取0.5 ml用細胞計數板行BALF細胞計數，余下的液體4 ℃，1000 r/min，離心10 min，取上清液-20 ℃保存。使用ELISA法檢測肺泡灌洗液中MUC5AC含量。

結 果

1 各組小鼠吸氣峰流速比較 灌胃結束后第2天，小動物生理儀記錄小鼠吸氣峰流速(Peak value inspiratory velocity of flow，PIF)值。與正常組比較，模型組、清熱潤燥各劑量組及陽性藥物組的吸氣峰流速比較，差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，清熱潤燥各劑量組及陽性藥物組的吸氣峰流速比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2 各組小鼠呼氣峰流速比較 灌胃結束后第2天，小動物生理儀記錄小鼠吸氣峰流速(Peak value expiration velocity of flow，PEF)值。與正常組比較，模型組呼氣峰流速明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。與正常組比較，清熱潤燥低劑量組呼氣峰流速減少，差異有統計學意義(P<0.05)。清熱潤燥中、高劑量組及陽性藥物組的呼氣峰流速相比正常組差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組比較，清熱潤燥低劑量組呼氣峰流速升高，組間比較無統計學意義(P>0.05)，清熱潤燥中、高劑量組及陽性藥物組的呼氣峰流速與模型組比較，均明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

3 各組小鼠呼吸頻率比較 與正常組比較，模型組及清熱潤燥低劑量組呼吸頻率(Respiratory rate，R)明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。清熱潤燥中、高劑量組及陽性藥物組與正常組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。清熱潤燥低劑量組呼吸頻率與模型組比較，差異無統計學意義(P>0.05)。清熱潤燥中劑量組的呼吸頻率低于模型組，清熱潤燥高劑量組及陽性藥物組的呼吸頻率與模型組比較，均減少，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

1993年，美國國會通過的《政府績效與結果法案》，首次從立法上對美國聯邦機構績效評價做出了制度性規定。該法案將資源和管理決策與績效掛鉤，建立以績效為目的的預算制度，將美國政府的績效管理重點由“過程問責”轉向“結果問責”，由“投入—產出”模式轉為“目標—結果”模式[3]，促使聯邦部門和機構在預算中加強“戰略—目標—預算—績效”的閉環管理，提高政府管理績效和服務效率。

4 各組小鼠肺組織病理學比較 根據HE染色結果可知，正常組小鼠氣管內可見少量黏液，氣管黏膜上皮完整、管腔內無黏液滲出及炎癥細胞浸潤；模型組小鼠氣管內有黏液，可見嗜酸性粒細胞，黏液細胞不規則增生，上皮細胞壞死脫落；血管和氣管周圍，肺泡間隔可見大量炎細胞浸潤；清熱潤燥低劑量組小鼠支氣管管腔可見黏液栓，管壁各層可見炎細胞浸潤，平滑肌增生，血管和氣管周圍，肺泡間隔可見大量炎性細胞浸潤；清熱潤燥中劑量組小鼠血管及氣管周圍可見炎性細胞浸潤，氣管壁增厚，細胞增生；清熱潤燥高劑量組小鼠氣管擴張，氣管和血管周圍可見少量炎性細胞浸潤，血管內可見中性粒細胞；陽性藥物組小鼠血管及氣管周圍可見炎細胞浸潤，氣管壁增厚，細胞增生(圖1)。

表1 各組小鼠吸氣峰流速、呼氣峰流速及呼吸頻率比較

圖1 各組哮喘小鼠肺組織病理學表現(HE染色，×20)

5 各組小鼠氣道杯狀細胞比較 根據PAS染色結果(圖2)，正常組小鼠支氣管壁可見零星幾個杯狀細胞，呈紫紅色，管腔內無黏液分泌；模型組小鼠氣管壁可見有大量的深染杯狀細胞增生，呈紫紅色，個別管腔內黏液分泌明顯；清熱潤燥低劑量組小鼠與模型組比較，氣管壁中杯狀細胞減少，呈紫紅色，腔內無黏液分泌；清熱潤燥中劑量組小鼠與模型組比較，管壁中的杯狀細胞較模型組明顯減少，呈紫紅色，個別支氣管未見杯狀細胞；清熱潤燥高劑量組小鼠與模型組比較，支氣管壁見少量杯狀細胞，呈紫紅色，腔內無黏液分泌；陽性藥物組小鼠支氣管壁有零星幾個杯狀細胞，呈紫紅色，管腔內無黏液分泌。

6 各組小鼠BALF中MUC5AC蛋白表達比較 與正常組比較，模型組、清熱潤燥低劑量組BALF中MUC5AC蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義(P<0.01)。清熱潤燥中、高劑量組和陽性藥物組MUC5AC表達與正常組比較，差異無統計學意義(P>0.01)。與模型組比較，清熱潤燥低劑量組MUC5AC表達有所下降，但無統計學意義(P>0.05)；陽性藥物組及清熱潤燥中、高劑量組MUC5AC表達下降更多，組間比較差異均有統計學意義(P<0.01)。

7 各組小鼠BALF中AQP5表達比較 與正常組比較，模型組BALF中AQP5表達明顯減少，清熱潤燥各劑量組和陽性藥物組AQP5表達明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，清熱潤燥低劑量組AQP5增加無統計學意義(P>0.05)；陽性藥物組及清熱潤燥中、高劑量組的AQP5，與模型組比較均具有統計學差異(P<0.01)。見表2。

8 各組小鼠BALF中IL-13表達比較 與正常組比較，模型組BALF中IL-13含量明顯增加；清熱潤燥低劑量組、中劑量組中IL-13均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。清熱潤燥高劑量組、陽性藥物組中IL-13與正常組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，清熱潤燥低劑量組中的IL-13差異無統計學意義(P>0.05)；陽性藥物組，清熱潤燥中、高劑量組中的IL-13含量與模型組比較，差異有統計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠BALF中MUC5AC、AQP5、IL-13表達比較

討 論

哮喘是多種炎癥因子參與的氣道慢性炎癥性疾病[6]，炎性因子IL-13是哮喘發作的重要原因，其在黏液分泌中作用較為明顯，MUC5AC作為氣道黏液中最為重要的黏蛋白,是呈IL-13誘導性表達，健康人氣道中MUC5AC含量很少[7]，MUC5AC與哮喘慢性炎癥引起的氣道黏液高分泌有密切關系[8]；水分是氣道黏液的重要組成部分，氣道黏液95%以上都是水分，而水通道蛋白通過調節生理和細胞對液體體積和滲透壓變化的反應，來進行整個生物體內水分平衡的基本系統調節[9]，在肺組織中，水通道蛋白5是主要的水轉運通道之一，其減少將導致氣道水分分泌的減少[10]，進而引起氣道黏液的黏稠度增加，使其更加難以排出氣道。AQP5的異常表達與支氣管哮喘水液代謝失衡及氣道黏液高分泌有著密切聯系，是近年來研究支氣管哮喘發病機制的新方向[11-13]。

在本次實驗中，哮喘模型小鼠氣道病理染色表現出炎細胞浸潤、MUC5AC明顯增多，提示構建的模型符合氣道黏液高分泌模型。與模型組比較，地塞米松組及清熱潤燥中、高劑量組炎細胞浸潤較模型組好轉，且能明顯減少IL-13、降低MUC5AC的表達同時增強了AQP5蛋白的表達。黏蛋白分子原本參與組成呼吸道黏液，有保護和潤滑上皮的作用，但在感染、過敏原等多種因素的影響下，氣道上皮分泌MUC5AC便顯著增加，引起了氣道黏液的高分泌[13]；AQP5主要分布在哺乳動物的唾液腺、肺泡Ⅰ型細胞、上呼吸道分泌上皮細胞等[14-15],作為肺組織中主要水通道蛋白,可幫助水分子快速通過質膜移動，幫助氣道及肺內液體的吸收及轉運,并參與氣道黏液的分泌與調節[16]。哮喘患者，尤其是慢性哮喘或者咳嗽變異性哮喘的患者，常常感覺咽干、痰難以咯出，這是腺體結構或功能受損、唾液分泌減少所致，而腺體，尤其是涎腺的分泌調控作用與AQP5的異常分布密切相關[17]。根據本次實驗結果，清熱潤燥口服液可增加BALF中AQP5的表達。本次實驗中與正常組比較，模型組BALF中IL-13含量明顯增加，證明氣道黏液高分泌的小鼠IL-13值是升高的，低劑量組小鼠BALF中的IL-13含量比模型組低，地塞米松藥物組及清熱潤燥中、高劑量組中的IL-13明顯降低，結合本次實驗MUC5AC及AQP5的結果，提出IL-13與MUC5AC值呈正相關，與AQP5值呈負相關的設想，但其具體的作用機制及通路有待研究。

哮喘屬于中醫“哮病”的范疇，《癥因脈治·喘促》：“哮病之因，痰飲留伏，結成窠臼，潛伏于內，偶有七情之犯，飲食之傷，或外有時令之風寒束其肌表，則哮喘之癥作矣”。“痰”常由咳吐、咳咯而出，中醫有“肺為嬌臟，喜潤惡燥”之說，或因環境等“外燥”原因、或因飲食、遺傳等“內燥”原因或內外原因共同致病導致“內外合燥”傷及肺臟，灼傷肺津，肺失宣肅，上焦水津不能通降與布散，便停聚于肺化為痰飲，痰伏于肺，成為發病的潛在“夙根”，此類“伏痰”色黃或白而黏稠，堅而成塊[18]，遇各類誘因即發，但因其堅硬難排，故可見干咳、痰難咯等癥狀。所以從減少痰液生成、促進痰液排出，通過“潤養”與“通利”[3]治療本病。

潤養，一取其潤養脾胃之效，其中沙參、麥冬合用，益氣且養胃陰,脾胃為人體氣機升降的樞紐，脾胃功能正常則中氣盛，津液上可輸布于肺，配合白扁豆、山藥等補脾、實脾之品起“培土生金”之效，下能滋腎，以達“金水相生”之功[19]。肺腎互資，陰津充盛，達“潤養”以化燥。二取其潤養肺臟之效，肺為嬌臟，喜濕惡燥，方中桑葉為君藥，苦能潤燥、甘能生津，其性清輕上揚，其形同肺葉，故最能入肺經潤肺燥，津液滋潤肺部，使伏痰、燥痰得以潤化，而得以排出。通利，其一通利氣道得伏痰能排出，其二通利水道，使津液能潤布各個臟腑。除了健脾胃、滋潤肺腎使津液得以布輸之外，甘寒之蘆根為佐藥，清熱生津，利濕通利，宣肺氣于上而通達水濕于下，蘆根及薏苡仁、冬瓜仁三藥合用通利三焦,浙貝母配以陳皮行氣利痰,使痰得以“通利”隨氣化外達,氣道通暢，肺之宣降功能正常,氣可載津，津液輸布有則；水道通暢，津液充足以助氣化，既可正常布散津液又可使邪外排，是以本方以辛涼甘潤之法潤養脾胃、資肺津腎陰，通利氣道水道使運化有則，氣道順暢，津液得以輸布、痰濁得以排出。

本實驗發現本藥對于慢性哮喘或者哮喘合并慢性阻塞性肺疾病，尤其是以干咳、痰液難以咯出為主要癥狀的患者效果更佳，由此提出，清熱潤燥口服液潤養與通利的理論，是通過其激活上皮細胞中AQP5的表達，改善了氣道的水液代謝，提高了肺組織濕的比重，從而稀釋痰液使其稀薄而易于排出，是以顯示了“潤養”氣道，稀釋痰液的作用，同時本藥可以拮抗哮喘氣道炎癥反應、減少MUC5AC的生成，通過減少氣道黏液的分泌起到“通利”氣道的作用，從而有效緩解哮喘發作時的咳嗽、喘息等癥。

綜上，本次實驗初步探討“清熱潤燥口服液”對哮喘小鼠BALF中MUC5AC以及AQP5的影響，證明本方可以通過抑制MUC5AC表達以及增強AQP5的表達來抑制氣道黏液高分泌、改善氣道炎癥以及調節氣道的水液代謝失衡，本次實驗的結果也部分符合“潤養”與“通利”的治療理論，但本次測試的因子較少，故其具體作用機制及通路有待進一步研究。