鵝不食草介導Nrf2/HO-1信號通路在腦缺血再灌注中抗氧化抗炎作用機制研究*

黃 鋼,馬善波,楊雙武,高海鋒

1.空軍軍醫大學西京醫院神經外科(西安 710032)；2.空軍軍醫大學西京醫院藥劑科(西安 710032)；3.西北大學附屬醫院(西安市第三醫院)(西安 710018)

腦卒中是由于血管阻塞或供血血管突然破裂導致血液無法流入腦組織造成的中樞神經系統損傷疾病[1]。2018年，《中國腦卒中防治報告》顯示腦卒中已成為我國成人第一死亡原因，也是成人殘疾的首要原因[2]。中醫中藥對卒中治療具有悠久的歷史，積淀了深厚的理論基礎。中醫認為腦卒中病變核心是氣血逆行上亂，主要病機是痰瘀阻滯腦絡，痰瘀郁久化熱產生各種毒性物質。病因多為飲食不節、情志失調、正氣不足及勞倦過度等。病性為本虛標實、上盛下虛，其中肝腎陰虛、氣血衰少為本，肝陽上亢、風火相煽、瘀血阻滯、痰濕雍盛為標。鵝不食草是一種雙子葉菊科植物石胡荽的全草，中醫記載具有祛風通絡、解毒消腫之功效。《本草綱目》評論鵝不食草上達頭腦而治頂痛目病，內達肺經而治痰瘧、散瘡腫[3]。現代藥理研究表明鵝不食草不僅具有抑菌、抗炎、抗氧化作用，而且具有一定的神經保護作用[4]，是一個極具研究價值和開發潛力的植物藥。但鵝不食草在腦缺血再灌注后抗炎抗氧化作用的研究較少。因此，本研究旨于建立腦缺血再灌注模型，探究鵝不食草對大鼠腦組織中氧化應激反應和炎癥反應的影響。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：72只7周齡雄性SD大鼠，SPF級，體重190～210 g，購自于并飼養于空軍軍醫大學動物實驗中心，飼養條件為溫度(23±2)℃、濕度50 %～60%、自由飲水攝食、12 h/12h晝夜節律、4只/籠飼養。

1.2 藥物與試劑：中動脈阻塞線栓(廣州佳靈生物科技公司)；鵝不食草醇提物(西安銳禾生物公司)；2,3,5-三苯基氯化銨(2,3,5-triphenyte-trazoliumchloride,TTC)染料(武漢塞維爾生物公司)；RIPA裂解液、BCA試劑盒(上海碧云天生物科技公司)；丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)試劑盒、谷胱甘肽(Glutathione r-glutamyl cysteingl glycine,GSH)試劑盒、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)試劑盒、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor -α,TNF-α)試劑盒、白介素1β(Interleukin 1β,IL-1β)試劑盒、白介素6(Interleukin,IL-6)試劑盒(南京建成生物功能研究所)；核因子E2相關因子2(Nuclear factor E2-related factors 2,Nrf2)抗體、血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase-1,HO-1)抗體、核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)抗體、β-actin抗體(美國Proteintech公司)；RT-PCR試劑盒(賽默飛世爾科技有限公司)。

2 實驗方法

2.1 模型的建立與分組：將72只SD大鼠按隨機原則分為假手術組、腦缺血組、依達拉奉組(5 mg/kg)、鵝不食草100、200、400 mg/kg劑量組，每組12只。除假手術組外，各組按參考文獻[5]中方法制備腦缺血/再灌注模型。大鼠應用400 mg/kg劑量水合氯醛完全麻醉后，仰臥位固定于手術臺上，頸部剪毛消毒。打開頸部皮膚，鈍性分離出頸總動脈并結扎頸外動脈、暫時阻斷頸總動脈、頸內動脈。自頸外動脈開口，插入線栓，前進至頸內動脈，以端點距離分叉處15 mm為終點。假手術組僅打開頸動脈不做插線處理。

2.2 給藥方法：術前稀釋鵝不食草提取物，濃度分別為40 mg/ml、20 mg/ml、10 mg/ml。各組術前2 h，鵝不食草灌胃給藥，按大鼠體重，每100 mg給藥1 ml。依達拉奉腹腔給藥，劑量5 mg/kg。術后持續給藥，1次/d，給藥3 d后檢測各指標。

3 檢測指標

3.1 神經功能評分：參考文獻[6]采用18分量表法評估大鼠神經功能，評分標準如下：觀察5 min內大鼠在籠中自發運動(0～3分)；身體懸空，觀察四肢伸展情況(0～3分)；后肢懸空，前肢在鼠籠上爬行，僅靠前肢行走，觀察前爪伸展運動(0～3分)；觀察大鼠攀爬能力(1～3分)；觀察大鼠身體觸覺反射(1～3分)；觀察大鼠觸須觸覺反射(1～3分)。得分3～18分范圍內。

3.2 模型大鼠腦梗死面積：水合氯醛深度麻醉大鼠，迅速斷頭取出腦組織，-80 ℃冷凍2 min后，連續切成6個冠狀切片，在2 %的TTC溶液中避光孵育15 min，將腦組織轉移到4 %多聚甲醛中固定，按順序展開并拍照。TTC染色后梗死區域呈白色，未梗死區域呈紅色。梗死面積占比=(梗死面積/該切片面積)×100%。

3.3 RT-PCR檢測大鼠腦組織Nrf2/HO-1和NF-κB的mRNA表達：應用實時定量PCR(qRT-PCR)法檢測Nrf2、HO-1、NF-κB p65表達。取大鼠缺血側皮質組織，液氮研磨，試劑盒提取總RNA。加入RT液、AWM逆轉錄酶反應，反應產物加入PCR液及上下游蛋白引物。反應液置于熒光定量PCR上進行擴增反應，條件：95 ℃、15 s；92 ℃、10 s；72 ℃、75 s；60 ℃、15 s；35 個循環；54 ℃、10 min。校正每個待檢測樣本的Ct值，計算△Ct，2-△△Ct即為目的基因的表達。目的基因引物序列：Nrf2：上游引物5’-ACGTAGATCGATATAGCTATGGGATCAGT-3’，下游引物5’-CTGATAGCTAGATATTCAGTATAGCTA-3’；HO-1：上游引物5’-ACGCTAGATATTTAGATAGATCGAT-3’，下游引物5’-ACGCTA-GATATGTTAGACTAGATCGAT-3’；NF-κB：上游引物5’-CAUGCCAGUGAGAAUGUAUGCCAU-3’，下游引物5’-ACGCAGGAGACGGAAGAAUAAAU-3’；β-actin：上游引物5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，下游引物5’-CCACAGGATTCCATACCCAA-3’。

3.4 Western blot 檢測大鼠腦組織Nrf2/HO-1和NF-κB p65蛋白的表達：取大鼠缺血側皮質組織，加入RIPA裂解液后靜置10 min，4 ℃條件下研磨呈漿狀，離心后使用BCA試劑盒測試蛋白濃度，加入Loading buff，煮沸后等量上樣。電泳90 min后濕法轉膜，脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗稀釋液4 ℃過夜。PBS洗膜3次，加入二抗稀釋液，室溫孵育2 h，洗膜并加入超敏發光液，以GAPDH作為內參，檢測Nrf2、HO-1和NF-κB p65蛋白表達。

3.5 檢測大鼠腦組織中氧化因子、炎癥因子含量：取大鼠缺血側皮層組織，加入PBS溶液研磨，離心取上清液，嚴格按照試劑盒說明書添加樣品、試劑，孵育抗體后酶標儀掃描波長。利用標準曲線計算出各組大鼠腦組織中氧化因子、炎癥因子含量。

結 果

1 鵝不食草對腦缺血模型大鼠神經功能評分的影響 假手術組未進行造模處理，所有大鼠評分均為滿分18分；與假手術組相比，腦缺血組大鼠神經功能評分降低，差異有統計學意義(P<0.05)，提示腦缺血模型造模成功；與腦缺血組相比，依達拉奉治療介導大鼠神經功能評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與腦缺血組相比，鵝不食草200 mg/kg劑量組和400 mg/kg劑量組升高了大鼠的神經功能評分(圖1)。

a：與假手術組比較，P<0.05；b：與腦缺血組比較，P<0.05

2 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦梗死面積的影響 假手術組因為沒有進行插線栓處理，所以沒有出現梗死區域。與假手術組相比，腦缺血組大鼠腦組織中出現顯著增加的梗死區域，量化統計達到了40%，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。與腦缺血組相比，依達拉奉組與鵝不食草200 mg/kg與400 mg/kg組大鼠腦梗死面積均減少，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1(圖2)。

表1 各組大鼠腦組織中梗死面積占比比較(%)

圖2 各組大鼠腦組織中梗死面積

3 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中氧化應激反應的影響 腦缺血組大鼠腦中抗氧化因子SOD、GSH水平變化差異無統計學意義(P>0.05)；腦缺血組氧化因子MDA、ROS表達均升高，與假手術組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。與腦缺血組相比，依達拉奉組、鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組均顯著增加了大鼠腦中抗氧化因子SOD、GSH表達，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，而氧化因子MDA、ROS的含量顯著降低，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠腦組織中抗氧化因子和氧化因子水平比較

4 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中炎癥反應的影響 與假手術組相比，腦缺血組大鼠腦中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達均升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與腦缺血組相比，依達拉奉組與鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組都顯著降低了腦缺血大鼠缺血半側腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6表達，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

5 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中Nrf2 mRNA、HO-1 mRNA及NF-κB mRNA表達的影響 與假手術組相比，腦缺血組大鼠腦中Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達差異無統計學意義(P>0.05)。與腦缺血組相比，依達拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組顯著升高了Nrf2 mRNA和HO-1 mRNA表達，差異有統計學意義(P<0.05)。與假手術組相比，腦缺血造成大鼠腦組織中NF-κB mRNA表達顯著升高，與腦缺血相比，依達拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組降低了NF-κB mRNA表達，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 各組大鼠腦組織中炎癥因子水平比較(pg/mg)

表4 各組大鼠腦組織中Nrf2 mRNA、HO-1mRNA及NF-κB mRNA表達比較

6 鵝不食草對腦缺血模型大鼠腦組織中Nrf2、HO-1及p-NF-κB p65蛋白表達的影響 與假手術組相比，腦缺血組大鼠腦中Nrf2和HO-1 蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。與腦缺血組相比，依達拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組均升高了Nrf2和HO-1 蛋白表達，差異均有統計學意義(P<0.05)。與假手術組相比，腦缺血造成大鼠腦組織中p-NF-κB p65蛋白表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，依達拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組均降低了p-NF-κB p65蛋白表達，差異有統計學意義(P<0.05)。見表5(圖3)。

表5 各組大鼠腦組織中Nrf2、HO-1及p-NF-κB p65 蛋白表達

圖3 各組大鼠腦組織Nrf2、HO-1及p-NF-κB p65 蛋白表達

討 論

腦卒中是一種臨床常見性疾病，具有較高的致殘和致死率。中醫將腦卒中歸于“中風”的范疇，總病機屬于陰陽失調，氣血逆亂[7]。易水學派認為：“凡人年逾四旬，氣衰之際，因憂喜憤怒傷其氣者，多有此疾”，即正氣不足是中風的重要病因[8]。至清代王清任總結中醫中風理論首創“氣虛血瘀”之理論，即氣血逆行，痰瘀郁滯所致瘀痰熱毒是造成中風的關鍵[9]。因此，清熱解毒，化瘀通絡是中風治療的重要方向。鵝不食草在中醫藥中應用廣泛，《本草匯言》中記載，其味辛烈，其氣辛熏，其性升散，能通肺經，上達頭腦，故有祛痰通氣、散寒祛邪之功效。其去目翳障，并頭中寒邪、頭風腦痛疾，皆取辛溫升散之功也。故本研究采用鵝不食草作為缺血性腦卒中治療藥物。

現代研究認為腦卒中往往與腦組織中氧化/還原因子調節失衡相關。Nrf2/HO-1信號通路是調節機體氧化應激反應的重要機制。Cen等[10]研究顯示腦梗死缺血區皮質中Nrf2和HO-1等蛋白表達量在24 h明顯上升。Nrf2在機體中扮演著氧化應激反應感受器的角色。HO-1是Nrf2下游蛋白，是一種抗氧化酶，在抗氧化應激發生時清除氧自由基片段方面發揮作用。生理條件下，細胞中Nrf2主要存在于細胞質中，通過與Kelch 樣環氧氮氯丙烷相關蛋白(Kelch-like ech associating protein,Keap1)連接形成Nrf2-Keap1復合物，保持著無活性狀態且極易發生降解。當機體氧化應激反應增加時，Keap1-Nrf2復合物通過Keap1巰基修飾和Nrf2磷酸化方式，使其各自構象發生變化，從而使Nrf2與Keap1發生解離，且Nrf2移位進入細胞核，與核內抗氧化應激原件結合[11]，激活抗氧化酶HO-1的基因轉錄，發揮抗氧化作用，減少神經元損傷或死亡，從而起到神經保護作用[12]。馬行凱等[13]研究顯示小鼠腦缺血模型中Nrf2的表達是一個動態變化過程，缺血區Nrf2在再灌注2 h后表達增加，且在8 h時達到頂峰，而在24 h和72 h后開始減少，最終與假手術組無異。然而，也有與此不同的研究結果，肖宇等[14]研究發現在腦缺血再灌注24 h時，Nrf2與HO-1表達量顯著上升。本研究發現，再灌注72 h后，腦缺血組Nrf2 mRNA與蛋白表達與假手術組沒有統計學差異，與馬行凱等的研究一致。此外，與腦缺血組相比，依達拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組則顯著增加了大鼠腦組織中Nrf2與HO-1 mRNA和蛋白含量表達。氧化應激試劑盒檢測顯示，依達拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組顯著增加了大鼠腦組織中抗氧化因子水平，減少了腦組織中氧化因子水平，說明依達拉奉與鵝不食草通過Nrf2/HO-1信號通路改善大鼠腦組織中氧化應激反應。

腦缺血引起的氧化損傷還可以繼續激活腦組織中炎癥反應，導致大量細胞因子和炎癥介質釋放。與Nrf2相似，NF-κB是一種多功能核轉錄因子，受Keap1介導的IκB激酶β(IκB kinases β,IKKβ)調控。生理條件下，Keap1與NF-κB形成復合物，維持無活性狀態且易降解。當Nrf2信號缺失會導致NF-κB p65與抑制因子IKKβ快速磷酸化，復合物被水解分離[15]。胞漿內NF-κB p65移位進入細胞核，發揮基因調控作用，促進下游TNF-α、IL-1β和IL-6等大量炎性細胞因子分泌。有研究應用siRNA敲除血管內皮細胞keap1基因，誘導Nrf2依賴的抗氧化酶表達增加，減少ROS在細胞內的積累，而ROS則是NF-κB活化必不可少的[16]。本研究中，與假手術組相比，腦缺血組大鼠腦中p-NF-κB p65 mRNA和蛋白表達顯著增加，介導腦中炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌增加，而依達拉奉組和鵝不食草200 mg/kg劑量組、鵝不食草400 mg/kg劑量組顯著減少了大鼠腦中p-NF-κB p65 mRNA和蛋白表達，顯著減少炎性細胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌。