基于整合藥理學探討腎復康Ⅱ號膠囊治療腎間質纖維化作用機制*

權浩浩，程小紅，杜 霞，張曉鳳△

1.陜西中醫藥大學(咸陽 712046)；2.陜西省中醫醫院(西安 710003)；3.陜西省中醫藥研究院(西安 710003 )

近年來，慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)的發病率在全球范圍內不斷升高。2012年的研究顯示，我國CKD發病率為10.8%[1]，這一數字說明CKD已經成為我國一個嚴峻的健康問題，給患者家庭和社會經濟帶來了沉重的負擔。腎間質纖維化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是多種腎臟疾病發展至終末期腎臟病的共同通路[2]，其主要特征是成纖維細胞的過度積累與細胞外基質沉積[3]。多項研究表明，延緩CKD患者RIF進展對保護患者殘余腎功能，延緩腎功能惡化具有重要意義[4]。但RIF是一個龐雜的動態過程，目前缺乏特異性的防治措施，現代醫學多以血管緊張素轉換酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)、TGF-β拮抗劑/阻滯劑為主要治療手段，但治療效果不佳。中醫藥具有辨證論治、個體診療的鮮明特點，中藥具有多靶點、靶點協同的干預效果。陜西省中醫醫院程小紅[5]教授將宏觀辨證與腎臟病理微觀辨證相結合，創制益腎散結復方腎復康Ⅱ號膠囊治療RIF。該方由山萸肉、菟絲子、熟地黃、金櫻子、淫羊藿、丹參、赤芍、姜黃、黃芪、山藥、王不留行、鱉甲(醋)等12味中藥組成。臨床應用多年，療效較好。但中藥復方具有藥味多、成分復雜的特點，因此我們對腎復康Ⅱ號膠囊治療RIF的物質基礎與作用機制尚不清楚。

整合藥理學( Integrative pharmacology，IP) 是研究多成分藥物與機體相互作用及其整合規律和作用原理的一門學科[6]。強調“整體與局部”“體內與體外”“體內過程與活性評價”等多層次、多環節的整合研究[7-9]。與中醫藥的“整體觀”“辨證論治”“方劑用藥”的特點不謀而合。本文以整合藥理學研究策略為手段，深入研究腎復康Ⅱ號膠囊治療RIF的作用靶點，明確其作用機制，為臨床應用提供理論依據。

資料與方法

1 腎復康Ⅱ號膠囊化學成分數據庫的建立 基于整合藥理學平臺V2.0的中藥材數據庫依次檢索腎復康Ⅱ號膠囊中對應藥材,收集藥物相似性得分(Drug-likeness weight)高于0.8的成分信息并依次編號，構建腎復康Ⅱ號膠囊的原始化學成分庫。腎復康Ⅱ號膠囊中的藥材鱉甲為鱉科動物鱉(Trionyx sinensis wiegmann)的干燥背甲,具有滋陰潛陽、軟堅散結、退熱除蒸之功效。鱉甲的主要化學成分為氨基酸、多糖、微量元素，具有免疫調節功能、抗腫瘤、抗肝纖維化等藥理活性[10]。因其作為動物藥材的特殊之處，加之整合藥理學平臺未收錄，故暫不將其納入研究。

2 腎復康Ⅱ號膠囊藥物靶標預測 整合藥理學平臺(TCMIP V2.0)以ETCM數據庫為基礎，該平臺具有中藥(含方劑)靶標預測和功能分析的強大功能。靶標預測原理是基于開源軟件Open Babel提取藥物化學成分MACCS分子指紋信息，并將化學成分的二維結構信息與FDA批準上市藥物進行化學指紋特征對比，以谷本系數(Tanimoto coefficient)定義的相似度計量方法進行相似性打分。本研究選取相似性打分值≥0.8的靶標為成分對應的潛在作用靶標，并以此作為化合物候選靶標。最后借助Uniprot數據庫對靶標名稱進行標準化處理，轉化為基因名稱，以便后續研究參考應用。

3 RIF相關基因收集 以“Renal interstitial fibrosis”作為檢索詞分別在疾病相關基因與突變位點數據庫(Dis Ge NET)、中醫藥百科全書數據庫(ETCM)及基因名片數據庫(Gene Cards)檢索、收集RIF相關基因，最后整合3個疾病數據庫的基因信息，進行去重復值處理，建立RIF相關基因數據庫。

4 靶標映射 將預測得到的化學成分預測靶標與RIF相關基因分別整理成Excle文件，導入Venn diagram進行靶標映射、取交集處理。

5 通路富集分析 DAVID數據庫是一個強大的生物信息數據庫，整合了生物學數據和分析工具，為大規模的基因或蛋白列表提供系統綜合的生物功能注釋信息。我們將靶標映射后得到的藥物和疾病共有靶標結果整理、導入DAVID 6.8，選擇“office gene symbol”，物種設置為“Homo sapiens”,基于KEGG通路數據庫進行通路富集。根據文獻報道的P<0.01、FDR<0.01，選取靶點數量較多的前20條通路來構建多維網絡。

6 “方劑-藥材-化合物-靶點-通路”網絡的構建 基于上述所獲得的腎復康Ⅱ號膠囊的藥材、成分、靶點、通路信息，采用Cytoscape軟件3.6.1構建“方劑-藥材-成分-靶點-通路”多維網絡，并利用自帶插件Network analyzer進行分析。以文獻中常用的度、介數中心度(Betweenness centrality)、緊密中心度(Close centrality)均大于平均值為依據對關鍵化合物及靶標進行識別，進而預測腎復康Ⅱ號膠囊治療RIF的物質基礎及分子作用機制。

結 果

1 腎復康Ⅱ號膠囊化學成分數據庫構成 基于整合藥理學平臺(TCMIP V2.0)共收集了腎復康Ⅱ號膠囊中11味藥材對應219個化合物。其中山茱萸32個、菟絲子5個、熟地黃9個、金櫻子14個、淫羊藿17個、丹參37個、赤芍16個、姜黃12個、黃芪24個、山藥35個、王不留行18個，進行去重復處理后得到198個化合物。

2 腎復康Ⅱ號膠囊藥物靶標預測 腎復康Ⅱ號膠囊中對應198個化學成分，共預測得到6030個靶標，進行去重復值后得到1011個靶標，以此作為腎復康Ⅱ號膠囊的藥物候選靶標。

3 RIF相關基因收集 通過檢索Dis Ge NET、ETCM和Gene Cards數據庫分別得到33個、14個、2107個RIF相關基因，整合檢索結果共得到2154個基因。剔除重復后，得到2117個RIF相關基因。

4 靶標映射 將得到的1011個藥物候選靶標與2117個RIF相關基因進行靶標映射，得到226個藥物及疾病共有靶標。認為這226個靶點可能是腎復康Ⅱ號膠囊治療RIF的直接作用靶點。

5 通路富集 KEGG通路富集結果顯示，226個藥物及疾病共有靶標共富集在138條通路上。根據P<0.01、FDR<0.01，確定了20條重要通路(圖1)，并以這20條通路為基礎來構建多維網絡。

圖1 KEGG通路富集結果圖

6 “方劑-藥材-成分-靶點-通路”網絡的構建與分析 根據方劑、藥材、成分、靶點、通路信息構建腎復康Ⅱ號膠囊“藥材-成分-靶點-通路”多維網絡(圖2)。該網絡有456個節點，紅色四邊形節點代表腎復康Ⅱ號膠囊，菱形節點表示藥材有11味，三角形節點表示疾病和藥物共同有化合物198個，圓形節點表示疾病和藥物共同靶標有226個，矩形節點表示關鍵通路有20條。邊有1822條，代表各節點之間的相互作用關系，表示藥材和化合物或化合物和靶標，或靶標與通路之間的聯系。借助Cytoscape軟件中的“Network analyzer”插件對網絡進行分析，以度、介數中心度、緊密中心度均大于平均值為依據對關鍵化合物及靶點進行識別，得到37個關鍵成分，36個關鍵靶點，選取度值較高的部分節點進行展示，見表1、2。SFK043(Adenosine，腺苷)、SFK005(Palmitic Acid，棕櫚酸)、SFK017(Ursolic Acid，熊果酸)、SFK075(Oleanolic Acid，齊墩果酸)、SFK059(Stearic Acid，硬脂酸)、SFK033(Quercetin，槲皮素)、SFK034(Kaempferol，山奈酚)、SFK002(Linoleic Acid，亞油酸)、SFK090(Baicalin，黃芩苷)、SFK058(Linolenic Acid，亞麻酸)、SFK081(3-O-Acetyloleanolic Acid，3-O-乙酰齊墩果酸)、SFK061(Kaempferitrin,山柰甙)等12個化合物自由度均大于20。雄激素受體(Androgen receptor，AR)、糖皮質激素受體(Glucocorticoid receptor，NR3C1)、核因子NF-κB p105亞基(Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit，NFKB1)、芳烴受體(Aryl hydrocarbon receptor，AHR)、維生素D3受體(Vitamin D3receptor，VDR)、雌激素受體(Estrogen receptor，ESR1)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)等7個靶標的自由度值均大于30。我們認為這些度值較高的化合物可能是腎復康Ⅱ號膠囊治療RIF的主要藥效成分，度值較高的靶標可能是腎復康Ⅱ號治療RIF的重要靶標。另外，網絡分析發現單味中藥可對應多個化合物，同一化合物可與多個靶標具有相互作用關系，同一靶標可富集于不同的信號通路上，這一現象說明了中藥治療疾病"多成分、多靶標、多通路、靶點協同"的作用特點。

圖2 “腎復康Ⅱ號膠囊-藥材-成分-靶點-通路”網絡圖

表1 腎復康Ⅱ號膠囊主要活性化合物信息

表2 腎復康Ⅱ號膠囊關鍵靶標信息

討 論

腎復康Ⅱ號膠囊以益腎散結為組方原則，切實符合RIF“腎虛血瘀”的核心病機。方中淫羊藿、菟絲子、金櫻子、熟地黃、山萸肉、山藥、黃芪同用，共奏溫補腎陽，助陽化氣之效；配伍丹參、赤芍、姜黃、王不留行、鱉甲(醋)，消瘀化痰散結；標本兼顧，扶助正氣，祛除瘀血積滯，共奏益腎活血之效。

通過構建益腎散結復方腎復康Ⅱ號膠囊 “藥材-成分-靶點-通路”的多維網絡后發現，SFK043、SFK005、SFK017、SFK033、SFK034等化合物自由度最高。且存在不同藥材對應同一種成分，一個靶標對應多個化合物的情況。我們認為上述成分可能是該復方的主要藥效成分，相關研究也表明上述成分可通過不同機制干預RIF。其中腺苷可激活A1受體，通過抑制腎臟炎性因子表達、腎髓過氧化物酶激活等途徑干預RIF的進程[11]。熊果酸與齊墩果酸是一對同分異構體，屬五環三萜類化合物，具有抗糖尿病、抗炎及變態反應、調脂抗肥胖等作用[12-14]。TGF-β1是經典的促纖維化因子，過度表達可導致腎小球系膜細胞增生，基底膜增厚。而文獻報道熊果酸含藥血清可通過下調 TGF-β1表達，抑制炎癥狀態下系膜細胞增殖[15]。槲皮素、山奈酚屬于黃酮類化合物，其中槲皮素能夠通過抑制MCP-1、PAI-1和Col-Ⅰ的表達而部分逆轉TGF-β1誘導的腎小管上皮細胞細胞外基質的積聚[16]，可顯著抑制系膜細胞增殖，使系膜細胞維持在相對穩定的狀態[17]。山奈酚可緩解高糖誘導的糖尿病腎病大鼠腎組織病理性損傷,抑制細胞凋亡和炎癥反應[18]。

在“方劑-藥材-成分-靶點-通路”網絡中自由度較高的靶點有AR、NR3C1、NFKB1、AHR、VDR、ESR1、TNF、CASP3等。其中雄激素受體屬于核受體超家族成員，與雄激素結合后參與血壓、血糖、血脂及人體內皮功能的調節[19]。腎小管間質纖維化程度是反映腎功能下降嚴重程度和判斷疾病預后的最重要指標，炎癥是其主要的發病機制[20]。TNF-α是浸潤細胞產生的重要的促炎因子，可以刺激腎小管上皮細胞產生趨化因子，招募炎癥細胞，誘導腎小管上皮轉分化或凋亡[21]。糖皮質激素受體,是配體依賴的轉錄活化因子，有α、β兩種亞型，而糖皮質激素主要與α結合發揮抗炎、抑制免疫炎癥等作用。NF-κB是由轉錄因子p65與轉錄因子p50構成的二聚體蛋白，是調節各種基因表達的轉錄因子，具有“開關效應”。在正常腎小球細胞、腎小管上皮細胞中表達，在異常活化狀態下，可促進成纖維細胞向肌成纖維細胞轉化。

圖1顯示富集靶點數量最多的是PI3K-Akt信號通路。該通路是胰島素信號傳導的主要途徑，也是調控、維持血糖平衡的主要信號通路。HIF-1信號通路與缺氧、貧血、炎癥的發生、發展密切相關。 cAMP信號通路，稱為第二信使，是細胞內非常重要的信息傳遞通路，對于胞外信息具有迅速傳遞和信號放大的特點。

綜上，本研究整合藥理學研究策略與方法，挖掘到復方中11味藥材中198個成分及1011個靶標，2117個疾病相關基因，得到226個共有靶標，并行KEGG通路富集，最后通過構建、分析“藥材-成分-靶點-通路”網絡。初步預測到腎復康Ⅱ號膠囊可能通過調節AR、NR3C1、NFKB1、AHR、VDR、ESR1、TNF、CASP3等靶點，調控PI3K-Akt 信號通路、cAMP 信號通路、Rap1 信號通路、HIF-1 信號通路等。通過干預炎癥反應、氧化應激、調節血壓、血糖和血脂發揮對于RIF的治療作用。