翅果油蜂蜜特征物的識別及應用

任彩君 趙柳微 王凱 薛曉鋒 趙艷萍 吳黎明

（1 中國農業科學院蜜蜂研究所；2 山西玉漿堂蜂業科技有限公司）

1 引言

翅果油樹（拉丁學名：Elaeagnus mollis Diels.）是胡頹子科胡頹子屬落葉直立喬木或灌木，屬國家一類保護樹種，僅在中國山西和陜西兩地有少量分布。翅果油樹的種子、樹葉等部位含有豐富的營養物質，其中樹葉中不飽和脂肪酸占脂肪酸總量的77%以上，亞麻酸占不飽和脂肪酸的70%以上[1,2]。翅果油樹開花早，花蜜含量大，花粉營養價值高，是一種理想的蜜源植物。

翅果油蜂蜜是蜜蜂從翅果油花中采集花蜜，并在蜂巢中充分釀造而成的天然甜物質[3]。分析發現，翅果油蜂蜜中富含維生素、脂肪酶、磷酸酶、蛋白酶、淀粉酶和蔗糖酶等人體代謝不可缺少的物質，適合補給免疫力低下人群[4,5]，同時還具有改善尿頻、睡眠和調節胃腸道功能等作用[5]，是一種產量較少的優質特色蜂蜜。但目前還未形成翅果油蜂蜜特征鑒別技術，有被摻假的潛在風險，也無法從功能組分角度與其他種類蜂蜜區分。

近幾年，本團隊已經建立了鑒別不同蜂蜜特征與功能的成熟方法和應用模型。本研究利用代謝組學和統計學分析技術，對翅果油蜂蜜、翅果油樹的花所含化合物進行異同比對，旨在探究翅果油蜂蜜中的特征識別物，提供針對翅果油蜂蜜的鑒別方法并確定蜂蜜特征物的閾值范圍，為進一步開發利用翅果油蜂蜜提供技術支撐。

2 實驗部分

2.1 儀器、試劑與材料

Milii-Q純水機，美國Millinpore公司；電子分析天平，METTLER-TOLEDO公司；混合振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造責任有限公司；N-EVAP112氮氣吹干儀，美國OA-SYS公司；超高效液相色譜-高分辨質譜（UHPLC-Q-TOF/MS，6545），美國安捷倫科技有限公司。

色譜級甲醇，Fisher公司；Sep-Pak C18固相萃取小柱，Waters公司；0.22μm尼龍膜，津騰公司。

分析樣品：2018年、2019年從山西翼城的翅果油種植區域周邊的蜂場，采集翅果油蜂蜜，共36個樣品，同時采集了相同地點的翅果油樹的花樣品12個。實驗室備存的油菜、洋槐、棗花蜂蜜各3個樣品，共9個樣品。

2.2 樣品前處理

稱取蜂蜜樣品各5g，加入10ml去離子水，震蕩溶解后60kHz功率超聲10min。將樣品加入預先用5ml甲醇和5ml純水活化的C18固相萃取小柱，調節流速1～1.5ml/min，待樣品溶液全部流出后，用10ml純水淋洗C18小柱，負壓下抽干。用8ml甲醇洗脫，收集洗脫液，常溫下氮氣吹干。用1ml甲醇復溶，0.22μm尼龍濾膜過濾，進樣。

翅果油樹的花/芽研磨成粉末，分別稱取2g加入10ml甲醇，8000g離心10min，取上清液，0.22μm尼龍濾膜過濾，進樣。

2.3 超高效液相色譜-高分辨質譜檢測的條件

色譜條件：色譜柱Agilent Eclipse Plus C18（2.1×100mm，1.8μm）；流動相為含0.1%甲酸水溶液（A）、含0.1%甲酸乙腈溶液（B）；進樣量2μl；柱溫40℃；流速0.3ml/min。

質譜條件：ESI離子源；載氣溫度320℃；氣體流速8l/min；噴霧器壓力40psi；毛細管電壓3500V；鞘氣溫度350℃；鞘氣流速11 l/min；負離子掃描模式。

表1 梯度洗脫程序

3 結果與討論

由于翅果油蜂蜜是蜜蜂采集翅果油花的花蜜并在蜂巢中經過充分釀造而成的，因此考慮翅果油蜂蜜特征物與翅果油花密切相關[6,7]。將翅果油蜂蜜與翅果油植物花中的化學組分進行對比，找到兩者并存的化合物，發現共有170多種化合物，通過Metlin數據庫檢索，找出匹配度大于85%的化合物，作進一步篩選并利用保留時間和化合物精確質量數兩個指標與標準品比對確認，α-亞麻酸標準品及蜂蜜中對應的提取離子m/z277.2173、保留時間18.2min，色譜圖見圖1、圖2，亞油酸標準品及蜂蜜中對應的提取離子m/z279.2330、保留時間19.1min，色譜圖見圖3、圖4。

圖1 α-亞麻酸標準品提取離子m/z277.2173色譜圖

圖2 翅果油蜂蜜提取離子m/z277.2173色譜圖

圖3 亞油酸標準品提取離子m/z279.2330色譜圖

圖4 翅果油蜂蜜提取離子m/z279.2330色譜圖

查閱文獻發現，李喬等在翅果油樹葉中檢出α-亞麻酸[8]，宋雙紅等在翅果油樹種子油中檢出亞油酸[9]，馮寶英在翅果油樹種仁中檢出亞油酸[10]。本研究從翅果油蜂蜜中檢出α-亞麻酸、亞油酸，表明翅果油蜂蜜與翅果油植物不同部位共同含有α-亞麻酸、亞油酸。但有研究表明，個別品種蜂蜜中也含有α-亞麻酸、亞油酸[11-13]。本研究也在油菜、洋槐、棗花蜂蜜中檢出少量α-亞麻酸、亞油酸，單獨以蜂蜜中是否含有α-亞麻酸、亞油酸難以判定是否為翅果油蜂蜜。

為此，我們采用定量法進一步確定了翅果油蜂蜜中α-亞麻酸、亞油酸含量，發現所有翅果油蜂蜜樣品的α-亞麻酸含量均不小于100mg/kg、亞油酸含量均不小于10mg/kg，且α-亞麻酸、亞油酸的濃度比在（10～13）∶1之間，與其他蜂蜜中α-亞麻酸、亞油酸濃度比在（1～3）∶1之間，存在顯著差異。因此將α-亞麻酸（≥100mg/kg）、亞油酸（≥10mg/kg）、α-亞麻酸/亞油酸濃度比（10～13）∶1，聯合作為翅果油蜂蜜特征識別參數，以提高鑒別的準確性。

4 小結

本研究基于UHPLC-Q-TOF/MS技術并結合代謝組學及統計學分析手段對翅果油蜂蜜的化學成分進行分析，并結合相關文獻報道確定以α-亞麻酸、亞油酸作為翅果油蜂蜜特征識別物[14,15]，且滿足：α-亞麻酸含量≥100mg/kg，亞油酸含量≥10mg/kg，α亞麻酸與亞油酸濃度比在（10～13）∶1之間。利用該鑒別方法能夠準確識別翅果油蜂蜜，研究方法和模型也為其他蜂蜜品種鑒別提供了可靠思路和有效辦法。

同時，翅果油蜂蜜較高的α-亞麻酸和亞油酸的濃度比（10～13）∶1，也有助于調節和平衡現代膳食結構中亞油酸含量相對較高、亞麻酸含量相對較低的情況[16]，食用翅果油蜂蜜有助于人體健康。