水果風味物質的生物制備技術

孫君燕，姚凌云，宋詩清，孫敏，王化田，馮濤

（上海應用技術大學香料香精技術與工程學院，上海 201418）

我國水果種類豐富，果實香氣怡人，濃郁的水果香氣深受大眾的喜愛。香氣成分是水果品質的重要特征之一，水果是否受消費者喜愛，風味是重要的影響因素。但是，風味是個極其復雜的概念，它包括水果在入口前后對人的視覺、嗅覺、味覺、觸覺等一系列器官刺激所形成的一種綜合印象[1]。水果風味物質主要分為酯類、醛類、內酯類、萜類、羰基化合物和一些含硫化合物，這些化合物的含量會隨著水果的種類和品質發生變化。

目前水果風味物質研究已成為一門新興學科。早期水果風味物質的研究報道多見于草莓、葡萄等，通常采用蒸餾法從天然植物中制備而來，但是該方法受材料、提取條件、設備等的影響，尚不能滿足大眾對風味物質的需求。隨著社會的發展，細胞培養、基因工程、微生物轉化等生物技術制備水果風味物質逐漸成熟。鑒于此，本文對水果風味物質的生物制備技術研究進展進行了綜述，旨在為今后水果風味物質的研究、開發與利用提供參考。

1 細胞培養技術

早在20 世紀50 年代，利用生物技術合成風味物質的趨勢已經開始活躍，到21 世紀開始盛行。細胞培養制備風味物質方法是隨著生物技術的發展而誕生的一種新型技術，此方法可以不受環境條件的影響而進行大量制備，并進行工業化生產[2]。與化學合成相比，細胞培養法更加安全，避免了金屬離子和有機溶劑對食品和環境的污染[3]，但目前對細胞培養和細胞代謝途徑的過程認知較為有限。根據生產手段，細胞培養技術可分為兩類：微生物法和酶法；它們還可分為兩大類，即利用代謝細胞在微生物發酵過程中進行合成，以及通過微生物或酶對適當前體進行生物轉化[4]。

微生物發酵生產水果風味物質主要是借助微生物在有氧或無氧的條件下，制備微生物菌體，或者通過直接代謝或次級代謝產生水果風味物質。微生物發酵不僅可以改善香氣成分，使水果中的不良氣味消失，還可以改變水果的品質、增加營養成分，已廣泛應用于食品工業中。微生物發酵是一個很有前景的生產天然風味物質的方法，目前各個行業都在試圖通過發酵生產天然風味物質，主要是大量生產消費者偏愛的風味物質。如天然香蘭素產品，市場需求量很大，工業生產每年需30 t 以上[5]，是世界上應用廣泛的調味劑。目前以阿魏酸為直接前體，采用沙鏈霉菌生產香蘭素的工藝已經非常成熟。萜類化合物是形成水果風味的重要物質之一，最常見的與風味相關的萜類化合物是單萜[6]。萜烯類化合物主要賦予香精油特殊的香味，是柑橘果實香氣的主要成分，有一定的生理活性，如祛痰、止咳、驅蟲、鎮痛作用。產生萜烯化合物的菌常見于腐爛的松樹上，如長喙殼屬（Ceratocystic）是目前廣泛研究的一類產香真菌[7]。內酯類化合物如果味、奶油味、甜味等會刺激人的味覺，其中果味指的是果香型化合物，是成熟水果散發的香氣，且伴有甜味。這類化合物主要通過化學合成的方法，若采用微生物發酵法，可以生產出具有旋光特性的內酯，例如利用土壤真菌綠色木霉在簡單培養基中進行細胞培養，可產生具有椰子味的物質[8]。吡嗪類化合物具有烘培或堅果的特殊風味，這類化合物是通過美拉德反應得到的，對于一些食品加工沒辦法進行美拉德反應的，無法獲得這類特殊風味，可以利用谷氨酸棒桿菌經過發酵產生四甲基吡嗪和萜類化合物[9]，添加到食品中，可獲得烘培或者堅果的特殊風味。還有一些菌可產生酯類化合物，如乙酸丁酯、乙酸乙酯、己酸乙酯、酪酸戊酯，這類化合物是水果的主要風味物質。

2 基因工程

利用基因工程能夠控制目的基因的表達，獲取目的性狀，從而得到更多種類的風味物質[10]。基因工程制備風味物質是當今食品工業上的一大趨勢，通過基因工程，能讓人們吃到種類豐富、風味特殊的物質。基因工程主要應用于草莓、葡萄和瓜果中，但改良果實風味成功的例子比較少，可能原因是對風味物質變化規律的研究較薄弱。科學家還利用反義基因技術并逐漸擴展到西瓜、香蕉、草莓、柑橘等，不僅可以延長果蔬的貯藏期，還可以提高果醬產率。反義基因技術原理是基于互補RNA 能形成雙螺旋結構，采用人工合成或生物合成的特異性DNA/RNA片段（或其修飾產物）封閉或抑制目的基因的表達[11]。例如苑平等[12]利用農桿菌介導法將氧化酶基因的反義鏈導入‘翠玉’獼猴桃，延長了果實軟化和風味存留的時間。

基因工程技術可以定向改變性狀，這種方法便捷、易于控制，目前在微生物發酵中應用較廣。在果酒的釀制中，可以利用基因工程技術，增加高級醇和酯的含量，使果酒變得更加濃郁、營養也更豐富。例如Chen YF 等[13]發現己酸乙酯是一種具有蘋果風味的酯類物質，將釀酒酵母醇己酰基轉移酶（ethanol hexanoyl transferase I）基因EHT1 進行了過表達，獲得了高產己酸乙酯的工程菌。劉伶普[14]將編碼醇酰基轉移酶的基因的過表達，提高了己酸乙酯和辛酸乙酯等中鏈脂肪酸酯的產量。劉燦珍[15]通過基因工程，控制高級醇及乙酸酯的合成，醇類主要是異戊醇，酯類主要是辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸苯乙酯，改變了葡萄果酒的整體風味。張良[16]利用基因工程將煙曲霉中的檸檬酸裂解酶基因導入釀酒酵母細胞，使藍莓汁中的檸檬酸裂解為丙酮酸，降糖快、發酵周期短，而且提高了藍莓酒的風味。總之，基因工程技術不僅能夠克服化學合成法和酶解法成本高的缺點，還能根據需要，獲得目標產物，具有廣闊的市場前景。

3 微生物轉化

人們從水果原材料中很難提取出風味物質，這一過程受到多種因素的影響，如所需風味物質濃度低、材料的季節性變化和天氣的變化無常，這些都會顯著影響風味物質的產量和質量。由于生物技術的進步，提取風味物質正日益成為工業化生產的目標。風味物質生產過程中的微生物轉化是指一種微生物或多種微生物將一種物質轉化為另一種物質[17]，該過程需要微生物產生的酶參與反應。如果在培養基中提供特定的基質，微生物轉化經過氧化、還原、水解、脫水、新C-C 鍵的形成，最終生產所需的風味物質。含有大量所需前體的天然來源的化合物可直接用作基質[18]，例如倍半萜是精油中提取的萜烯，是研究微生物轉化最受歡迎的底物，也是橙油中較為廉價的成分[19]，具有較高的經濟價值。微生物轉化方法若可以廣泛應用在工業上，將擴大原有物質本身的價值。

3.1 內酯類

內酯主要是指由γ-羥基酸和δ-羥基酸組成的環狀酯[20-21]，有助于增加黃油味、奶油味和水果味。內酯主要是通過化學方法產生的，但與化學合成相比，微生物轉化在活性成分的生產以及催化效果方面更加優秀。例如γ-癸內酯（γ-decalacton，GDL）存在于水果和發酵產品中，張婧[22]克隆格氏乳球菌的油酸水合酶，協同解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）轉化油酸合成γ-癸內酯，以γ-羥基不飽和脂肪酸為底物，采用分枝孢子菌（Cladosporium suaveolens）進行生物轉化生產γ-癸內酯；王萍萍[23]則利用凍土毛霉（Mucor hiemalis） 和卷枝毛霉（Mucor circinelloides）將癸酸乙酯經氧化、酸化、提取和蒸餾等步驟獲得癸內酯。趙玉萍[24]采用固定化細胞轉化技術，減少了底物和產物對細胞的毒性，篩選出獲得高產γ-癸內酯的耶魯維亞解脂酵母（Yarrowialipolytica），提高了γ-癸內酯的產量，對桃子香、椰子香及奶油香等香氣物質的形成具有重要意義[25]。

3.2 酯類

酯是常用的調味劑，具有果香味，廣泛應用于水果制品中，使產品具有水果味。乙酸乙酯與丁酸乙酯廣泛存在于蘋果、梨等水果中，是構成花果香氣的主體成分[26]。乙酸乙酯、乙酸己酯、乙酸異戊酯和2-苯基乙酸乙酯被認為是葡萄酒和其他葡萄汁酒精飲料中的重要風味化合物[27-28]，它們可能是酵母菌、霉菌、細菌產生的。在酒類飲品中，脂肪酸乙酯是釀酒酵母產生的次級代謝物，其中C6-C12 的脂肪酸酯對飲品風味貢獻最大。醇和酸的直接酯化主要由細菌和真菌進行，例如紅曲霉能夠促進己酸、丁酸及混合酸與乙醇的酯化作用，生成的酯類物質均為己酸乙酯[29]。許春艷等[30]進行單因素和正交法優化，確定最佳產酶條件，篩選出合成己酸乙酯性能較高的紫色紅曲霉，為后續菌種酯化能力的研究奠定基礎。

3.3 萜類

萜類化合物通常是造成精油特有氣味的最重要成分，廣泛存在于植物中。單萜類化合物廣泛分布于自然界，具有高揮發性，是生物技術生產風味化合物的理想原料[31]。萜類化合物中，與水果風味相關的最常見的是單萜，如檸檬烯和α-蒎烯[32]。檸檬烯是檸檬的特征香氣，被用作揮發性化合物轉化的底物；Rottava 等[33]分離篩選出黑曲霉能夠將檸檬烯轉化成α-松油醇；Ferrara 等[34]發現解脂耶氏酵母可將檸檬烯轉化為紫蘇酸，以及一些細菌如假單胞菌也可進行生物轉化。萜類化合物大多數具有苦味，但有些也具有甜味，例如甜菊苷[35]。用微生物生產單萜類物質，對果蔬風味合成具有重要的意義。

3.4 羰基

羰基存在于酮和醛中，它們呈現出獨特的氣味特征，有助于產生揮發性化學物質的風味屬性。酮主要對奶酪風味有貢獻，例如呋喃酮是草莓果實中最重要的香氣成分。醛類中最常見的是苯甲醛，天然苯甲醛通常從杏仁核中釋放出來，苯甲醛是僅次于香蘭素的第二大揮發性物質，可以通過苯甲醇作為碳源生產苯甲醛。Sindhoora 等[36]發現甜瓜揮發物中的重要組分有酯類（27.29%）、醛類（18.57%）、雜環化合物（16.63%）。在木瓜中，醛類物質占10%左右，例如十六醛、十八醛、庚烯醛等，酮類有巨豆三烯酮、β-紫羅蘭酮等。在菠蘿和草莓中，2(5H)-呋喃酮具有生物活性，能夠抗病毒和抗菌等[37]。4-羥基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮是具有水果香味和焦糖味的一種物質，在食品工業和化妝品中應用廣泛。酮類物質通常是利用微生物代謝合成，而能代謝合成該種呋喃酮的微生物主要有魯氏結合酵母[38]、乳酸菌[39]、畢赤酵母[40]等。

3.5 酸

具有香氣的酸主要有乙酸、丁酸、己酸、癸酸、異丁酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、辛酸、苯乙酸、丙酸和戊酸。宋云花等[41]從云南乳制品分離出乳酸菌作為輔助發酵劑，添加到Cheddar 干酪的制備中，控制溫度、pH，且不影響干酪的組成成分，將水果風味增加了3 倍左右。許多有價值的香料和香料組成物可以由微生物從作為前體添加的脂肪酸中產生，包括提供綠色氣味的化合物、特定的內酯等。微生物發酵中，利用丁酸梭菌在厭氧的條件下可將葡萄糖轉化為丁酸[42]。丁酸是具有干酪香味的物質，還可與乙醇發生酯化，生成丁酸乙酯，是具有果香味的香氣成分，但該方法制備香氣成分的成本高于化學合成法。

4 結論

水果深受廣大消費者的喜愛，但風味物質的產生受水果原料、外界環境、栽培條件以及生物合成途徑相關酶活性的影響。隨著消費者對營養和美味食品需求的增加，導致人們對可能被視為天然美味材料的需求增加，可以通過生物技術解決這一系列問題。本文主要是從細胞培養技術、基因工程、微生物轉化這三種生物制備技術獲取水果風味物質進行探討。采用細胞培養技術可以彌補在化學合成上存在的諸多安全風險的問題，但細胞培養由于在植物代謝過程知識上的局限，現在還存在產量低、培養環境不易控制等問題。基因工程在改善水果風味方面重要的優勢是可以在特定的器官、細胞層，甚至單個細胞，通過基因轉移的方式改變植物的特性，但基因工程在世界上的安全性還有待考察。微生物轉化可以將低價值的物質轉化成高價值的，但這一技術還不成熟。隨著社會的發展及知識體系的完善，現代分離技術如超臨界流體萃取技術、分子蒸餾技術的應用，以及分析儀器準確度的提高，生物技術將會在食品工業上有更廣闊的應用前景。