食源血管緊張素轉化酶抑制肽研究進展

王琳琳，陳立，李建科

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安 710119）

高血壓是常見的心血管疾病，嚴重危害人類健康。發病人群年齡分布廣泛，據世界衛生組織報道，全球1/3的成年人患有高血壓[1]。我國第五次高血壓調查顯示：中國成人高血壓患病率為23.2%，患病人數達2.45 億[2]。患病率隨年齡增加而升高，男性高于女性[3]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（renin-angiotensin system，RAS）在高血壓疾病的形成及發展中扮演著關鍵性的角色[4-5]。RAS 是升壓系統，腎素使血管緊張素原釋放出血管緊張素Ι（Ang Ι），在ACE 作用下轉化為血管緊張素II（Ang II），使血管強烈收縮，血管壓力增大，與腎小球細胞上的AT1 受體相互作用而驅動醛固酮的合成和分泌，刺激去甲腎上腺素釋放和Na+重吸收，使血壓升高。緩激肽在激肽原酶的作用下產生舒緩激肽（BK），進而釋放血管舒張因子，對抗Ang II，使血壓下降[6]。ACE 能夠降解BK 使其失活，從而使機體血壓升高。RAS 和激肽釋放酶-激肽系統（kallikrein-kinin system，KKS）在血壓調節中相互拮抗，只有平衡協調才能維持正常血壓。高血壓為常見病，患者人數眾多且需終身服藥。

ACE 抑制肽又稱為降壓肽，是一類能夠抑制血管緊張素轉化酶活性的多肽。目前化學合成的ACE 抑制劑類藥物臨床效果并不理想，且有一定的副作用。食源性蛋白獲得的ACE 抑制肽可以降低血壓，而且更加安全，近年來已有較多研究人員在食品原料中提取出ACE 抑制肽，通過體外體內試驗證明其具有抑制活性，進一步研究能夠推進臨床應用，造福高血壓患者。目前只有少數發酵來源的ACE 抑制肽商業化使用。ACE 抑制肽沒有固定結構，通過不同來源ACE 抑制肽的制備可以進一步探究肽的結構與活性之間的關系，促進降壓肽的開發并取代化學合成抑制劑。鑒于此，本研究分析了ACE 抑制肽的降壓機制和構效關系，總結了ACE 抑制肽的制備方法及來源，探討了其未來的研究方向，旨在助力食源ACE抑制肽的研究與開發，助力高血壓等重大心血管疾病的預防和特殊人群的健康改善。

1 ACE 抑制肽降壓機理

ACE 在人體血壓調節系統中發揮著重要的作用，ACE 抑制肽可以通過抑制ACE 活性，使Ang II 濃度降低，從而起到降血壓的作用。ACE 抑制肽是對ACE 活性區域親和力較強的競爭性抑制劑，對ACE 的親和力比Ang Ι 和舒緩激肽要強，而且不易從ACE 結合區釋放，從而阻礙Ang II 的生成和緩激肽的水解，起到降血壓的作用。當前最有效的降血壓藥物是琉甲丙脯氣酸（商品名卡托普利），它是一種非肽類血管緊張素轉化酶抑制劑（ACEI），主要作用于RAS，雖然臨床降壓效果好，但是藥效時間不長，停藥后血壓易反彈，并伴有咳嗽、味覺功能紊亂、皮疫及腎功能損害等副作用[7]。食源性ACE 抑制肽具有天然、安全、無副作用的優點，因此在醫藥、食品等領域備受青睞。

2 ACE抑制肽的構效關系

ACE 是一種二肽基羧基肽酶，根據分子量大小可分為體細胞ACE（sACE）和睪丸ACE（tACE）。sACE 由兩個同源結構域組成，每個同源結構域均含有Zn2+結合模體HEXXH（H 代表組氨酸、E 代表谷氨酸，X 代表任意氨基酸殘基）催化活性位點，只有C 端結構域在調節血壓方面起作用，tACE 結構與sACE 相似[8]。不同抑制肽的結構會導致不同的ACE 抑制類型，可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。競爭性抑制機理為ACE 抑制肽C 端氨基酸能與Ang 和緩激肽進行競爭，同底物爭奪ACE 結合位點，從而起到降壓作用。大多數ACE 抑制肽屬于競爭性抑制，ACE 抑制肽的C 端氨基酸是與ACE 活性部位結合的關鍵，當抑制肽的C 端氨基酸為疏水性氨基酸時，其ACE 抑制活性較高[9]。非競爭性抑制劑可直接與ACE 作用位點相結合，形成酶-抑制劑復合物，從而導致ACE 結構改變，抑制其活性。ACE 抑制肽的活性與其自身結構有關，C 端3 個氨基酸的序列為Phe-Glu-Pro 時，ACE 抑制活性最強。ACE 抑制劑的抑制活性還與立體構象及氨基酸的疏水性有關。但是這些結論沒有全面考慮肽的構象、與其他物質的相互作用等影響因素，許多ACE 抑制肽并不符合這些研究結果，因此，抑制肽ACE 與之間確切的構效關系模型至今仍未建立。

3 ACE 抑制肽的制備方法

食源性抑制肽的制備過程條件溫和，制備原料來源廣泛，因此可通過酶解、發酵或重組基因工程菌株等技術從動植物中制備ACE 抑制肽。

3.1 酶解法

酶解法是制備ACE 抑制肽最常用的方法，主要是通過蛋白酶水解原料蛋白質獲得具有ACE 抑制活性的片段。這種方法具有專一性強、效率高、反應條件溫和、反應進程易控制和產品安全性高等優點。缺點是需要對蛋白質原料進行篩選，鑒別具有降血壓活性的多肽結構；而且會形成苦味肽，影響水解產物的應用。制備ACE 抑制肽需要采用合適的酶，目前常用的蛋白酶主要有植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶等）、動物蛋白酶（如胰蛋白酶、胃蛋白酶等）、商業酶（如堿性蛋白酶、中性蛋白酶等）。酶解法主要包括單一酶解法和復合酶解法，制備ACE 抑制肽采用復合酶解法居多。Zhang 等[10]采用堿性蛋白酶和銅綠假單胞菌蛋白酶酶解小麥面筋，通過純化鑒定出兩個在羧基端含色氨酸的降壓肽：SAGGYIW 和APATPSFW，IC50值分別為0.002、0.036 mg/mL。Lee 等[11]分別采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解牛肉肌原纖維蛋白，發現通過堿性蛋白酶（AK3K）消化獲得的<3 kg/mol 肽顯示出最高的ACE 抑制活性（74.29%）。體內試驗表明該抑制肽對大鼠自發性高血壓具有明顯的降壓效果，經分析鑒定表明其具有Leu-Ile-Val-Gly-Ile-Ile-Arg-Cys-Val 序列。

3.2 發酵法

發酵法是利用微生物體內酶解反應釋放多肽片段，然后從發酵液中提取具有ACE 抑制活性的多肽。發酵法具有蛋白水解活性強、無需分離純化、成本低等優點，但反應進程不易控制。發酵法可通過改變發酵條件獲得高ACE 抑制活性的多肽，發酵菌種多采用乳酸菌。Sathya 等[12]采用嗜酸乳桿菌（MTCC 10307）、植物乳桿菌（NCDC 379）、干酪乳桿菌（NCDC 017）、保加利亞乳桿菌（NCDC 253）、副干酪乳桿菌亞種（NCDC 022）、鼠李糖乳桿菌（MTCC 8712）和瑞士乳桿菌（NCDC 192）七種不同的乳酸菌發酵山羊奶，結果在NCDC 379 發酵的牛奶中觀察到最高的ACE 抑制活性，分子量為1.4 kg/mol。李響等[13]選擇5 株乳酸菌、3 株霉菌和1 株枯草芽孢桿菌為出發菌種發酵大豆分離蛋白，結果發現乳酸菌中具有強ACE抑制活性的菌株為保加利亞乳桿菌，ACE 抑制率和肽含量分別為57.93%和3.27 mg/mL。

3.3 DNA 重組法

DNA 重組法是利用基因工程手段發酵制備ACE 抑制肽，將高ACE 抑制肽抑制活性的基因轉移至表達載體，使多肽基因以串聯多聚體形式表達獲得大量的ACE抑制肽。這種方法具有產量高、成本低等優點，但目前還沒有實現工業化生產。臧祥玉[14]采用基因工程法結合高密度發酵技術制備多種ACE 抑制肽和抗氧化肽的復合肽產品，構建基因工程菌多聚體BPP-1 使其正確表達。BPP-1 經體外模擬消化后，其酶解寡肽顯示了極強的ACE 抑制活性（IC50=0.004 mg/mL），體內檢測發現其具有較強的降血壓效應。

4 ACE 抑制肽的來源

食物中富含蛋白質，通過分解可獲得許多具有生理功能的生物活性肽。目前從乳源、植物源、動物源、海洋生物源、發酵來源等多種途徑制備出ACE 抑制肽，隨著研究的深入有望開發出功能性食品。

4.1 乳源ACE 抑制肽

乳制品富含蛋白質，是ACE 抑制肽的重要來源之一。乳源ACE 抑制肽是當前研究最廣泛和最深入的活性肽。酪蛋白和乳清蛋白含有多種生物活性序列，通過酶解條件優化可以制備多種ACE 抑制肽。在制備過程中酶解條件和肽的分子量是重要的影響因素。近年來許多學者陸續在乳源食品中獲得ACE 抑制肽。Guo 等[15]用藻酸鈉固定的瑞士乳桿菌LB 10 蛋白酶水解乳清蛋白，并對跨Caco-2 細胞單層轉運的能力進行了測試，得到ACE 抑制肽二肽和三肽KA、EN、DIS、EVD、LF、AIV 和VFK，其IC50值分別為1.24±0.01、1.43±0.04、1.59±0.27、1.32±0.05、1.60±0.39、2.66±0.02、1.76±0.09 mmol/L。Jiang 等[16]使用AS1.398中性蛋白酶水解牛奶酪蛋白，獲得新型的ACE 抑制肽RYPSYG 和DERF。Chen 等[17]采用復合酶水解羊乳酪蛋白，獲得高活性的ACE 抑制肽組分。馬瑩[18]采用胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶水解乳清蛋白制備ACE 抑制肽，經過純化篩選發現只有LIVTQTMK 有ACE 抑制活性，其IC50值為248.1 μg/mL。目前乳源ACE 抑制肽的研究處在臨床研究和少量應用階段。Crippa 等[19]通過隨機、雙盲安慰劑對照試驗研究了半脂奶酪Grana Padano 產生的ACE抑制肽對30 名輕中度高血壓患者的降壓作用，結果表明與Grana Padano 奶酪進行膳食整合的所有患者血壓均顯著降低，24 h（相對于安慰劑）收縮壓平均下降3.5 mmHg，舒張壓下降2.4 mmHg。目前已有許多包含乳源降壓肽的保健品投入應用，例如Calpis[20]、Evolu[21]發酵乳（包含VPP和IPP）、Festivo 奶酪[22]（包含RPKHPI、RPKHPIK、RPKHPIKHQ）。

4.2 植物源ACE 抑制肽

植物來源的ACE 抑制肽無毒副作用，且表現出良好的降血壓效果。植物源食品是ACE 抑制肽的重要來源，但如何從種類繁多的植物中獲得高ACE 抑制活性并具有開發價值的降壓肽仍需繼續研究。周劍敏等[23]用Alcalase堿性蛋白酶水解高粱堿溶蛋白，獲得ACE 抑制肽活性達到75.98%，在體外經胃腸道消化酶酶解后依然保持良好的抑制活性。王珂[24]采用超聲預處理輔助酶解玉米胚芽蛋白，發現梯度稀釋補料酶膜耦合模式獲得的多肽比等濃度補料酶膜耦合模式IC50值低11.70%，動物實驗結果表明該抑制肽降壓效果顯著。趙元暉等[25]對海地瓜蛋白水解物進行分離純化，得到強活性ACE 抑制肽MEGAQEAQGD，其IC50值為15.9 μmol/L，動物實驗結果表明該抑制肽對大鼠自發性高血壓具有明顯的降壓效果。Cao 等[26]利用胰蛋白酶對龍須菜進行酶解，對酶解產物進行分離純化后得到四肽QVEY，其IC50值為474.56 μmol/L。

4.3 發酵來源ACE 抑制肽

發酵制備ACE 抑制肽是一種綠色加工技術，發酵條件溫和，過程可控，中間產物少。發酵制備ACE 抑制肽需要分離篩選高效安全的生產菌株，并對培養條件進行優化以提高ACE 抑制肽產率，然后進行分離純化獲得高ACE 抑制活性的多肽。日本學者在發酵乳制品制備ACE抑制肽方面的研究較為深入。1995 年Nakamura 等[27]以L.helveticus CP790 和Saccharomyces cerevisiae 混合發酵制得酸乳Calpis，長期喂予原發性高血壓大鼠（SHR）后發現其能夠抑制血壓上升，并首次從酸奶中分離純化得到兩條ACE 抑制肽；Yamamoto 等[28]研究發現用L.helveticus CP790 發酵的酸奶產品，經過動物試驗發現其具有極強降血壓作用，并證實了這種抑制血壓上升的肽是由L.helveticus CP790 的胞外蛋白酶水解生成的。Chen 等[29]以植物乳桿菌L69 發酵羊乳酪蛋白，利用響應面法優化發酵條件，通過超濾純化得到的發酵產物對ACE 抑制活性達91.62%。體內試驗發現發酵的山羊奶能夠在胃腸道中成功存活，并保持較高的抑制活性。Xia 等[30]從植物乳桿菌發酵產生的乳清蛋白中純化出IC50值為1.26 mg/mL 的ACE 抑制肽，經過動物試驗發現其具有很強的降壓作用，通過液相色譜-串聯質譜分析表明其具有Gly-Ala 的氨基酸序列。Chen 等[31]以納豆芽孢桿菌發酵菲律賓蛤仔獲得ACE 抑制肽，將發酵產物純化分離，得到具有高ACE 抑制活性的新型肽（IC50為8.16 μmol/L），并鑒定出其氨基酸序列為Val-Ile-Ser-Asp-Glu-Asp-Gly-Val-Thr-His（VISDEDGVTH），體外體內實驗表明該肽具有顯著的降壓作用，可作為降壓功能性食品的有益成分。

4.4 動物源ACE 抑制肽

動物的組織器官富含蛋白質，研究人員從中提取出具有ACE 抑制活性的多肽。動物源ACE 抑制肽和植物源ACE 抑制肽的制備方式類似，主要通過酶解方式獲得，但是有研究表明動植物蛋白經體外消化后蛋白肽的ACE 活性抑制率不同[32]。從動物源食品中獲得的ACE 抑制肽仍需在體外和體內進一步驗證。鄧惠玲等[33]以豬血為原料制備血紅蛋白，用胃蛋白酶進行酶解得到ACE 抑制肽GGLP。Mirdhayati 等[34]酶解卡康山羊肉，得到具有Phe-Gln-Pro-Ser 序列的新型肽（IC50值為27.0 μmol/L），發現該肽在體內和體外均能有效抑制ACE。

海洋生物蛋白是食源性ACE 抑制肽的重要原料來源。海洋生物及其加工副產物中含有豐富的生物蛋白，可以制備ACE 抑制肽，進行高值化利用。ACE 抑制肽的制備多采用酶解法，單一酶類獲取的多肽多數活性不高，一般使用復合酶進行酶解，酶解產物需要進一步分離純化，以獲得高活性的海洋多肽。華鑫等[35]利用復合蛋白酶對刺參體壁進行酶解制備ACE 抑制肽，經動物實驗表明它對雄性SHR 有良好的降壓效果。Ghassem 等[36]對鯉魚肌原纖維蛋白用蛋白酶K 和嗜熱菌蛋白酶進行水解，發現嗜熱菌蛋白酶的水解產物ACE 抑制活性最大，純化的水解產物中分離出兩個強抑制肽VPAAPPK 和NGTWFEPP。

5 展望

高血壓作為世界范圍內最常見的重大慢性病之一，是心血管疾病的“無聲殺手”。食源性ACE 抑制肽可以有效預防緩解高血壓，并且制備原料廣泛，可以從食物加工邊角料和廢棄物中獲取，具有良好的再利用價值。目前的食源ACE 抑制肽研究多集中在制備和結構分析上，鮮少涉及到降壓機制。代謝組學、蛋白質組學和全基因組學技術的興起有助于我們更深入地研究食源ACE 抑制肽在體內的降壓機制，為人類健康發展提供有效依據。同時，目前臨床應用的ACE 抑制肽較少，需要進一步研究其臨床功效、在人體內的生物利用度和組織親和力等。相信這些問題在不久的將來都會得到解決，并實現工業化生產。

隨著ACE 抑制肽在世界范圍內的廣泛關注，動植物源ACE 抑制肽資源豐富但作用機制不清，研發富含ACE抑制肽的功能性食品將成為未來食品科學領域和食品加工行業的重點和難點。