豬胚胎冷凍技術的研究歷程與未來展望

（吉林大學動物科學學院，吉林長春 130062）

胚胎工程是一項綜合性的動物繁育技術，對于畜牧業生產有著十分重要的意義。胚胎冷凍保存是胚胎工程中的重要環節，也是動物保種、基因庫建立的必要手段。利用胚胎冷凍保存技術能夠保存珍稀動物品種和優良生產性能家畜的遺傳資源，促進克隆和轉基因技術在生物醫學研究方面的發展，推廣胚胎移植技術在畜牧業生產中的應用。生豬生產作為我國畜牧產業重要組成部分，同時也是生物醫學產業重要的實驗動物來源。豬的克隆和轉基因技術在體細胞克隆、異種器官移植和蛋白質生產等方面具有良好的研究前景。值得注意的是，胚胎冷凍技術也是轉基因技術的重要環節。目前，在大多數哺乳動物中胚胎冷凍技術已逐漸成熟和穩定，利用玻璃化冷凍技術對各個發育階段的胚胎進行冷凍保存均已獲得成功。然而，由于豬胚胎的特殊理化性質，導致豬胚胎冷凍保存的研究進展十分緩慢。因此，建立和優化豬的胚胎冷凍體系的研究既具有重要的理論意義也具有重要的應用價值。

1 豬胚胎常規冷凍

胚胎的冷凍保存是指將胚胎和冷凍劑裝入凍存管中，經過降溫后使胚胎的生命活動暫時靜止，并能夠通過升溫恢復正常生命活動的保存過程。哺乳動物胚胎冷凍技術最先使用的方法是緩慢冷凍法，Whittingham等[1]通過逐漸降溫（0.3～2℃/min） 到 - 80℃后投入液氮中，將小鼠胚胎保存8 d后，取出冷凍的胚胎，通過胚胎移植后可成功繁殖后代。這一方法使哺乳動物胚胎的冷凍保存成為可能。但是由于降溫控制和實驗設備等要求較為苛刻，距離實際應用還有一定距離。之后，Willadsen等[2]在此基礎上進行了改良并開發了快速冷凍法，將胚胎置于冷凍劑中，1℃/min -的速度緩慢降溫至 40℃時投入液氮中保存。在解凍時，直接放入25℃的溫水中快速解凍。這種方法由于操作過程時間較短，操作流程簡便，因此得到廣泛應用。這2種常規程序化冷凍方法在牛[3]、羊[4]、馬[5]甚至人類[6]胚胎中成功應用并繁殖了后代。

傳統的胚胎冷凍方法在豬繁殖方面一直無法成功應用。研究發現，豬胚胎具有低溫敏感性，當達到一定生理溫度（15℃）時，便會造成不可逆轉的生理損傷。Wilmut[7]和Polge等[8]首次提出胚胎的低溫耐受性與脂質含量有關。Fujino[9]和Nagashima等[10]的研究證實在豬胚胎發育過程中不同時期胚胎內脂質含量存在顯著差異。胚胎在發育初期脂質含量高，耐低溫能力差。直至發育至桑葚胚后，脂質含量顯著下降，胚胎才能夠冷凍保存，因此，發明了離心冷凍法。通過離心將細胞內脂質離心至胚胎的一側，然后通過顯微操作將聚集的脂質液滴從胚胎中去除。去脂后，顯著提高了豬胚胎的低溫耐受性。基于這一方法，研究人員成功將2～8細胞期的胚胎以常規緩慢冷凍法保存[11-14]。然而，研究一直未能成功通過胚胎移植獲得后代，或成功率極低且試驗無法重復。這一問題直到玻璃化冷凍技術的出現，才得以解決。在我國研究歷史中，張德福等[15]通過開放式拉長細管（Open Pulled Straw,OPS）玻璃化冷凍法，首次獲得了豬胚胎超低溫（-196℃）冷凍后代。

2 豬胚胎玻璃化冷凍

玻璃化冷凍（Vitrification）方法于1985年由Rall等提出。玻璃化是指高濃度的冷凍劑在高速降溫時可以由液態轉變為非晶體的固態，這種狀態保存了分子和離子的正常分布，不會形成冰晶結構從而保護細胞形態的完整。玻璃化冷凍是將胚胎置于高濃度的冷凍劑中，細胞外高滲透壓和勢能使胚胎脫水，同時細胞質內源性的大分子物質濃縮和冷凍劑中保護物質的滲入，使其降溫時進行玻璃化而不形成冰晶。

1994年Dobrinsky[16]首次應用玻璃化冷凍法，使用甘油作為冷凍劑成功保存了豬的擴張期囊胚和孵化囊胚。從此，豬胚胎玻璃化冷凍技術開始迅速發展，并逐步進行改良。1997年Vajta[17]開發了OPS玻璃化冷凍法。具體方法是將0.25 mL的冷凍細管加熱拉長，使其直徑降低至0.88 mm，并使管壁厚度降低至0.07 mm。因為管壁較薄，溫度傳導性好，使胚胎迅速通過冰晶形成的危險溫區以減少冷凍造成的細胞損傷。由于細管內部體積小，可有效地減少冷凍劑使用，降低冷凍劑的細胞毒性造成的細胞損傷。基于此原理，科研人員開發了超細開放式拉長細管冷凍技術（Superfine Open Pulled Straw,SOPS）和玻璃化快速冷凍儀冷凍技術（Vit-Master-SOPS）[18]。利用以上2項技術，研究人員發現，保存的擴張期囊胚存活率和孵化率不受影響，但保存的桑葚胚和初期囊胚的孵化率還是有所下降[19]。進一步的研究表明，在沒有去除脂質的情況下，利用OPS技術甚至能夠保存2～4細胞期的胚胎[20]。因為無需進行脫脂處理，因此胚胎保留了完整的透明帶。玻璃化的桑葚胚和囊胚進行胚胎移植后，成功獲得了后代仔豬[18,21-23]。同時發現，OPS玻璃化冷凍會顯著降低初期胚胎的存活率[20]。綜合之前的研究結果，研究人員將脂質離心技術和OPS玻璃化冷凍技術相結合，顯著提升了早期和孵化囊胚期冷凍胚胎的存活率[24,25]，而且使體外生產的胚胎（In Vitro Production of Embryos,IVP）也能夠得到保存。

為了滿足農業生產需求和達到生物醫學研究的標準，胚胎的冷凍保存需要盡量保持透明帶的完整，以保證生產的穩定性和較高的生物安全性。但是在機械離心脫脂法中，使用玻璃針在透明帶穿刺以去除脂質的操作，顯著增加了胚胎污染的風險。同樣，在玻璃化冷凍中部分操作方法需要樣品直接與液氮接觸來提升降溫速率，這同樣也增加了胚胎冷凍和存儲過程中被污染的風險[26-28]。基于這些需求，胚胎保存技術開始進一步改進。Li等[29]提出了一種不需要顯微操作的胚胎脫脂冷凍保存方法，即使用胰蛋白酶處理胚胎或者將胚胎處置于高滲透壓溶液中，以擴大卵周間隙，之后通過離心使極化的脂質滴與卵裂球的細胞質之間的橋狀結構破裂，導致脂質滴無法重新分布到胚胎的卵裂球中，而是保留在完整的透明帶內，從而降低胚胎冷凍過程中脂質含量上升導致的低溫敏感性。這種方法降低了操作造成的污染風險，同時也提升了工作效率，使IVP胚胎的商業生產成為可能。從另一角度出發，為了降低直接接觸液氮造成的污染，Misumi等[30]開發了微風量空氣冷凍法（Micro Volume Air Cooling,MVAC）。他們研發了一種特殊的設備結構，避免了胚胎冷凍劑和液氮的直接接觸，有效的降低了污染風險。但由于設備結構的特殊性，離實際應用仍有一定差距。

3 豬胚胎玻璃化冷凍的研究方向

3.1 玻璃化冷凍劑的改良

冷凍劑作為凍存胚胎的直接載體，對其進行改良可有效地保護細胞結構，提升胚胎耐低溫能力。冷凍劑根據其作用方式，可以分為滲透性冷凍劑和非滲透性冷凍劑。滲透性冷凍劑是指具有可以進入細胞質中特性的冷凍劑，一般為小分子物質。其中常見的有二甲基亞砜（DMSO）、乙二醇（EG）、丙二醇（PG）、甘油（GL）等。非滲透冷凍劑則不能進入細胞，其通過改變細胞外滲透壓來降低胚胎內水分含量，包括蔗糖、葡萄糖、聚乙烯醇（PVC）等。研究表明，這2類冷凍劑對豬囊胚保存的作用效果無顯著性差異[31]。高劑量冷凍劑在使細胞脫水的同時也存在細胞毒性，有研究證明根據胚胎狀況可以適當降低冷凍劑濃度，不會降低冷凍效果[32,33]。但關于冷凍劑濃度和處理胚胎時期的研究，仍有待探索和改良。

新型冷凍劑的研發也是十分重要。1992年Rubinsky等[34]首先發現了魚抗凍蛋白質（AFGPs）并添加在抗凍劑中，顯著提升了冷凍的豬卵母細胞的活性。抗凍蛋白質可以與哺乳動物細胞膜相互作用，阻止冰的結晶化和晶體的生長，保護細胞膜結構。抗凍蛋白的應用，提供了冷凍劑改良的新思路，一些天然的蛋白質或多肽開始被研究并應用于冷凍劑中。例如ε-聚賴氨酸（ε-PL），它是一種有抑菌活性的L-賴氨酸大分子聚合物，具有有效濃度低、安全無毒、水溶性好等優點。研究發現在冷凍液中添加30 g/L的ε-聚賴氨酸（ε-poly-lysine），平衡1 min，冷凍效果最好，囊胚期胚胎的存活率達91.2%，孵化率達89.7%。Maki Kamoshita等則通過添加ε-聚-L型-賴氨酸（ε-poly-L-lysine）成功冷凍了豬原核期胚胎。因此，關于冷凍劑成分的改良仍有很廣泛的研究空間。

3.2 玻璃化冷凍流程的優化

從最開始的OPS玻璃化冷凍法，到SOPS和Vit-Master-SOPS技術的改良，玻璃化冷凍承載工具開始迅速發展。基于降低冷凍劑用量，提升溫度升降速度的最小體積冷凍（Minimum Volume Cooling,MVC）[35]的概念，研究人員開發了微滴冷凍法（Microdroplet），將胚胎和冷凍劑混合制作成冷凍液滴，直接滴入液氮中進行快速冷凍，收集冷凍形成的固態顆粒進行保存[36]。DinnyésA等[37]使用的固體表面玻璃化法 （Solid Surface Vitrification,SSV），將液氮更換為預冷至-150℃的金屬板，也具有同樣的效果。Lane等[38]研發的Cryo-loop工具是一個頂端固定了寬20 μm、直徑0.5～0.7 μm尼龍圓環的不銹鋼錐。在使用時先將Cryo-loop浸泡在冷凍劑中，利用液體的表面張力形成一層薄膜，再將胚胎轉移到薄膜上并直接投入液氮中保存。基于此原理，研究人員開發了極速冷凍薄膜（Cyrotop）。這種設計使胚胎的玻璃化體積達到了0.1 μL。發現使用Cryotop工具較微滴冷凍法，能夠顯著提升豬囊胚玻璃化冷凍的成活率[39]。

由于直接接觸液氮冷凍以及較為復雜的操作過程，如上文所述，這些方法還存在著種種弊端，無法滿足試驗和生產的要求。在保證冷凍效果的同時，也需要簡化生產操作，降低設備使用成本，以達到可以推廣使用的目的。因此，玻璃化冷凍流程的優化仍需要深入研究。

3.3 玻璃化冷凍與多組學研究

隨著測序技術的更新發展，生物領域的研究跨入了轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學等多組學聯合分析的時代[40]。多組學研究能夠從分子層面上解析復雜的生物學進程，使生物發育、衰老、死亡的機制研究更為深入透徹[41]。在胚胎冷凍方面，組學的研究才剛剛開展，而關于玻璃化冷凍對豬胚胎的組學研究則尚未報道。Miriam[42]和Bartolac等[31]通過qPCR檢測了玻璃化冷凍的胚胎中基因的差異表達。發現冷凍劑的添加并不會改變囊胚中胰島素樣生長因子2（Insulin-like Growth Factor 2,IGF2）和其受體（IGF2R）的基因表達。但玻璃化冷凍后會導致囊胚中的轉錄因子（POU Class 5 Homeobox 1,POU5F1）、熱休克蛋白 （Heat Shock Protein 70,HSPA1A）、IGF2和IGF2R等的基因表達發生顯著性改變。因此，使用轉錄組學從分子水平揭示胚胎玻璃化冷凍過程中發生的變化是可行的，進而使多組學的聯合分析成為可能。解析玻璃化冷凍影響胚胎生存率的作用機制，對未來玻璃化冷凍的改良具有重要的參考意義。

4 總結與展望

經過近40年對胚胎長期冷凍保存技術的研究和探索，至今該技術已在胚胎工程、動物繁殖和生物醫學等行業發揮了重要作用。雖然豬胚胎具有特殊的生物學特征，使其冷凍保存較為困難，研究進展也相對緩慢。但是，隨著生物技術的不斷發展，使得針對豬胚胎低溫敏感和冷凍損傷的分子機制探究成為可能。同時，隨著更多新型生物材料的研發和應用、胚胎冷凍保存技術的升級以及理論的不斷進步，使豬胚胎冷凍保存的商業化生產成為可能。