分子動力學模擬分析巴利昔凍干保護劑的活性保護機制

俞小娟，于傳飛，房森彪，王蘭

·論著·

分子動力學模擬分析巴利昔凍干保護劑的活性保護機制

俞小娟，于傳飛，房森彪，王蘭

102629 北京，中國食品藥品檢定研究院衛生部生物技術產品檢定及標準化重點實驗室/國家藥品監督管理局生物制品質量研究與評價重點實驗室（俞小娟、于傳飛、王蘭）；100191 北京大學藥學院天然藥物與仿生藥物國家重點實驗室（俞小娟）；410083 長沙，中南大學計算機學院（房森彪）

研究巴利昔單抗制劑中凍干保護劑蔗糖、甘氨酸、甘露醇的作用機制。

使用 Gromacs5.0.5 工具包，在 300K 的體系條件下，運用計算機模擬的方法，搭建模型，分別模擬分析了天然狀態、干燥狀態和添加復合保護劑的狀態下的巴利昔-Fab分子結構，從結構生物學的角度比較并分析凍干保護劑對巴利昔制劑的保護機制。

干燥狀態時，巴利昔分子的活性結構會有明顯塌陷，無規則卷曲數目明顯增多，分子間氫鍵數目減少，表面靜電性質也會因此有所變化，而在蔗糖、甘氨酸和甘露醇復合保護劑存在的情況下，以上情況能明顯得到改善，從而抑制巴利昔由于干燥失水而導致的結構塌縮和變性失活。

蔗糖、甘氨酸和甘露醇復合保護劑的使用能很好地保護巴利昔凍干制劑的活性。

巴利昔單克隆抗體； 活性結構； 保護機制； 分子動力學； 保護劑

巴利昔是以 CD25 為靶點的單克隆抗體藥物，可以徹底抑制細胞免疫反應中由 IL-2 介導的關鍵信號通路，從而達到抗免疫排斥的作用。因此被廣泛用于預防器官移植后的排斥反應[1-5]，商品化的巴利昔單抗（舒萊）是白色凍干塊狀物，在制劑的生產和凍干過程中，為了保護蛋白分子的活性，加入了蔗糖、甘氨酸、甘露醇等輔料，作為凍干保護劑。

蔗糖是蛋白質的非特異性穩定劑，化學性質穩定，多呈無定型結構，可在蛋白質表面形成單分子層，對阻止單抗制劑在凍干處理過程中蛋白質二級結構的改變及貨架期內蛋白質的伸展和聚集起顯著的保護作用[6]。甘氨酸在凍干的過程中可通過抑制蛋白質制劑中磷酸緩沖鹽結晶所致 pH 值的改變而阻止藥物的變性，阻止因蛋白質結構塌陷而引起的藥物的破壞[7]。1% 或更低濃度的甘露醇可通過無定型結構的形成阻止蛋白質藥物的聚集[8]。

隨著生物技術的迅速發展，越來越多的蛋白質藥物被開發出來，凍干制劑有著穩定、便于運輸、儲存等優點，在生物制品的凍干工藝中，為特定的蛋白質類藥物設計凍干保護劑和凍干方法是一項關鍵的工作。常用的凍干保護劑包括多羥基化合物、糖、氨基酸、聚合物以及吐溫等，聯合使用不同類型的保護劑可獲得穩定性更佳的凍干制品[9]。

目前，凍干保護劑的開發主要是基于傳統經驗的重復試錯。近年來，對于凍干保護劑及其保護機制的研究越來越深入，特別是隨著計算機技術的發展，在已知蛋白質結構的基礎上，通過數學建模的方式，對凍干過程中物料的真實狀態進行模擬解析，可以為凍干技術的完善與提高提供理論依據[10]。針對不同的生物制劑，開發更加優越的凍干保護劑，提高蛋白質藥物凍干制品的質量，是目前亟需解決的問題，也是現今生物技術藥物研究的重點方向。

本文運用計算機建模的方法，模擬了干燥狀態下蔗糖、甘氨酸和甘露醇與巴利昔單抗的相互作用的方式及其活性結構變化，從不同角度分析了蔗糖、甘氨酸和甘露醇復合保護劑對巴利昔單抗的活性保護效果及保護機制，從而為開發更具科學性和邏輯性的凍干工藝提供新的方法以及理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料

巴利昔-Fab 的結構信息來自 PDB（Protein Data Bank）數據庫http://www. rcsb.org/；蔗糖、甘氨酸和甘露醇的分子結構由Gaussview 5.0 構建；小分子結構優化軟件使用 Gaussian 09 軟件包；小分子對接軟件使用Autodock；分子動力學軟件使用 Gromacs 5.0.5。

1.2 方法

1.2.1 獲取巴利昔、甘氨酸、甘露醇和蔗糖的三維結構 巴利昔蛋白上的抗體結合區域，又稱 Fab 區域（抗原結合片段，每個 IgG 單抗分子含有2 個 Fab）。分子的天然原始結構（圖 1A）來自蛋白質晶體數據庫（Protein Data Bank，ID：3IU3）[11]，通過添加氯離子來平衡巴利昔-Fab 分子所帶的凈電荷（+5e）。蔗糖、甘氨酸和甘露醇的分子結構通過 Gaussview 5.0 構建并使用 Gaussian 09 軟件包[12-13]，采用 B3LYP/6-311++G**方法進行結構優化至收斂，優化后的分子結構如圖 1B、C、D所示。

1.2.2 建模及分子動力學模擬 使用 Gromacs 5.0.5 工具包在恒溫恒容（NVT）的條件下模擬了蔗糖、甘氨酸和甘露醇與巴利昔-Fab 分子在真空環境中的相互作用。分別構建三種模擬體系，即：天然狀態巴利昔-Fab 分子（Control）；干燥狀態下巴利昔-Fab 分子（Dry）；干燥狀態下巴利昔-Fab分子+保護劑（蔗糖、甘氨酸、甘露醇）（Protectant）。另外，在凍干工藝中，巴利昔制劑最終的水分含量約為 1%。因此，為了研究的準確性，同樣向模擬體系中添加了相應含量的水分子。Protectant 體系中含有 1 個巴利昔-Fab 蛋白分子，16 個水分子，以及 535 個甘氨酸、535 個蔗糖和 535 個甘露醇分子。

巴利昔-Fab 采用 Amber99sb-ildn 力場[14]，保護劑分子采用 Amber 通用分子力場，水分子模型選擇 TIP3P 模型。分子間 Lennard-Jones 與范德華相互作用的截斷半徑選擇 1.4 nm。靜電相互作用修正采用 Particle Mesh Ewald 方法。

首先，將巴利昔-Fab 分子初始結構置于 10 nm × 10 nm × 10 nm 的周期性盒子中。然后，在巴利昔-Fab 分子周圍隨機定量添加保護劑分子和水分子，并采用最速下降法進行 1000 步結構優化，再以 LINear Con- straint Solver（LINCS）[15]方法限制住所有化學鍵的鍵長，利用 Maxwell 分布設置體系各原子的初始速度。所有體系都在 300K 條件下進行模擬，并采用 Velocity-rescale 方法控制體系溫度，耦合常數選為 0.1。系統壓力采用 Berendsen 方法維持在 1 個大氣壓左右。之后，再將準備好的體系分別進行 5 ns NVT 限制性預平衡，使體系中保護劑分子和水分子在巴利昔-Fab 周圍均勻分布。最后，將處理好的體系模型在 NVT 系統下進行 100 ns 常規分子動力學模擬。對照組以同樣方法模擬，取模擬的最后 10 ns 軌跡進行數據分析。

相對自由能表征的是巴利昔-Fab 分子在不同體系下的熱穩定性，該自由能由 Boltzman function 計算，公式如下：() = –× ln(()) +其中()表示巴利昔-Fab 分子不同構象出現的概率，為常數。

2 結果

2.1 復合凍干保護劑對巴利昔-Fab 分子結構穩定性的影響

均方根偏差（RMSD）反映的是特定的構象與初始結構的偏離程度[16]，值越小表明該特定構象與初始結構越接近。圖 2A 為兩個體系中巴利昔-Fab 的均方根偏差隨時間變化的均值。從圖 2A 中可看出，添加了復合保護劑的巴利昔-Fab 分子（Protectant）的 RMSD 值相較于干燥狀態的巴利昔-Fab 分子（Dry）（0.40 nm）有了顯著降低，這表明在凍干狀態下蔗糖、甘氨酸和甘露醇可有效地增強巴利昔-Fab 分子活性結構的穩定性，使其更接近天然狀態。

圖 1 巴利昔-Fab（A）、甘氨酸（B）、甘露醇（C）和蔗糖（D）的初始三維結構

Figure 1 Natural 3D structure of basiliximab-Fab (A), glycine (B), mannitol (C) and sucrose (D)

圖 2 各體系中巴利昔-Fab 分子的 RMSD（A）與 Rg 值（B）

Figure 2 Root-mean-square deviation (A) and gyration-radius (B) of basiliximab-Fab in different systems

圖 3 巴利昔-Fab 分子在天然、添加復合保護劑和干燥三種體系中在相對自由能最低點的構象（A：三種體系中巴利昔-Fab 分子雙鏈直徑比較；B：添加復合保護劑狀態的巴利昔-Fab 分子雙鏈直徑與天然狀態的比較；C：干燥狀態的巴利昔-Fab分子雙鏈直徑與天然狀態的比較）

Figure 3 Compare of the conformation of basiliximab-Fab in natural state, with protectant and dry state in relative free energies minimal point (A: Comparison of double chain diameter value of basiliximab-Fab in three different system; B: Comparison of double chain diameter value of basiliximab-Fab in protectant and control system; C: Comparison of double chain diameter value of basiliximab-Fab in dry and control system)

回旋半徑（Rg）的定義為蛋白質結構中每個粒子與體系質心距離的幾何平均值，其值反映了粒子結合的緊密程度，即粒子結合越緊密，Rg 值越小。圖 2B 為各個體系中巴利昔-Fab 分子的Rg隨時間變化的均值。從圖 2B 可知，對照組（Control）中巴利昔-Fab分子的 Rg 是 3.28 nm，不添加保護劑組的巴利昔-Fab分子 Rg 是 2.82 nm，添加復合保護劑體系下巴利昔-Fab分子的 Rg 值是 3.09 nm。可見，相比于對照組的天然初始結構，巴利昔-Fab 分子在干燥狀態下，回旋半徑降低較多，這表明蛋白分子的內部結構由于水分的流失發生了塌陷和內陷，導致粒子結合更緊密，分子發生形變，但是，當添加復合保護劑時，回旋半徑的降低得到了改善，分子形變得到了抑制。

圖 3 為不同體系中巴利昔-Fab 分子在相對自由能最低點的構象，其中，天然狀態下巴利昔-Fab 分子雙鏈的直徑為 4.29 nm，干燥狀態下為 3.64 nm，添加復合保護劑狀態下為 3.85 nm，表明，復合凍干劑的添加，能有效抑制巴利昔-Fab 分子構象的改變。

2.2 不同體系中巴利昔-Fab 分子的自由能

體系內分子間相互作用的自由能反映的是分子間相互作用力的強弱，即熱穩定性，能量越低，體系越穩定，巴利昔-Fab 分子與水分子、保護劑分子之間相互作用，通過比較各個體系內分子間的相互作用的自由能，可評價各個體系的穩定性。由圖 4 可知，天然狀態體系的自由能最低，添加復合保護劑的巴利昔-Fab 分子體系次之，干燥巴利昔-Fab 分子體系的自由能最高。在天然狀態中，蛋白質、水分子、復合保護劑三者之間均存在相互作用，且保護劑具有親水性，水分子與保護劑之間存在較強的相互作用，降低了保護劑與抗體蛋白之間的相互作用，整個體系自由能最低，體系最為穩定；干燥狀態下，在添加了復合保護劑的體系中，保護劑可與蛋白質分子相互作用，蛋白質結構相對較為穩定；而僅有巴利昔-Fab 分子的體系在干燥狀態下，自由能急劇增加，狀態最不穩定。

圖 4 不同模擬體系下的自由能

Figure 4 Average interaction energy in different model system

2.3 復合凍干保護劑對巴利昔-Fab 分子表面親/疏水性質的影響

親/疏水表面積指的是蛋白質的親水和疏水殘基的溶劑可及表面積，其值越大則殘基在環境中的暴露面積越大。圖 5 為巴利昔-Fab 分子的可及平均親/疏水表面積。可以看出，與天然態相比，干燥狀態下的巴利昔-Fab 分子的疏水表面積顯著增加，同時，親水表面積顯著減小，最終導致親/疏水面發生反轉，可見，干燥之后的巴利昔-Fab 分子的結構發生了巨大的形變；在添加了復合保護劑之后，顯著減緩了巴利昔-Fab 分子的疏水表面積的增加，親水表面積的降低也有改善。由此可以推測，保護劑可以有效抑制巴利昔-Fab 分子疏水殘基的外翻和親水殘基的內卷，因此，保護劑可通過影響巴利昔-Fab 分子表面親/疏水表面積來影響分子結構的改變。

2.4 復合凍干保護劑對巴利昔-Fab 分子二級結構的影響

α-螺旋（α-helix）、β-折疊（β-sheet）和無規則卷曲（Loop）是蛋白質主要的二級結構構象，其中無規則卷曲柔性最大，狀態最不穩定。圖 6 展示了不同體系中巴利昔-Fab 分子二級結構的變化情況，從圖 6 可知，天然狀態的巴利昔-Fab 分子含有的無規則卷曲結構數目最少，添加復合保護劑的次之，干燥狀態下巴利昔-Fab 分子所含無規則卷曲結構的數目最多。由此可見，當在干燥環境中時，巴利昔-Fab 分子的二級結構會由α-螺旋和 β-折疊大量轉變成無規則卷曲，使得蛋白質的活性結構發生較大的改變，由于α-螺旋有助于提高蛋白質的熱穩定性，隨著巴利昔-Fab 分子的α-螺旋的解旋，無規則卷曲的增加，導致蛋白分子的熱穩定性降低，巴利昔的活性受到影響。而在添加了復合保護劑時，從一定程度上抑制了巴利昔-Fab 分子二級結構向無規則卷曲的轉變，從而起到活性保護的作用。

圖 5 巴利昔-Fab 分子的親/疏水表面積

Figure 5 Variation of the hydrophobic/hydrophilic surface of basiliximab-Fab

圖 6 不同體系巴利昔-Fab 分子的二級結構分析

Figure 6 Secondary structure analysis of basiliximab-Fab

2.5 復合凍干保護劑與巴利昔-Fab 分子相互作用分析

由以上結論可知，蔗糖、甘氨酸和甘露醇組成的復合保護劑可有效地維持巴利昔-Fab 在凍干狀態下的活性結構穩定性。保護劑對蛋白質類藥物的保護作用主要是通過分子間相互作用實現的，主要推動力是靜電相互作用，同時氫鍵也起一定的作用，糖和蛋白質之間形成的氫鍵，可抑制蛋白質在冷凍干燥過程中的構象改變[17]。為了探究氫鍵對該保護作用的影響，我們統計了截斷半徑 0.35 nm 范圍內巴利昔-Fab 分子在三種體系時分子間形成的氫鍵數目以及可及表面積（圖 7）。結果表明，干燥狀態下的巴利昔-Fab 分子間氫鍵數目最少，為 168 個，天然狀態下的巴利昔-Fab分子間氫鍵數目最多，為 263 個，添加復合保護劑狀態下氫鍵數目為 210 個。由此可見，保護劑的添加，可有效增加氫鍵的形成，從而增加巴利昔-Fab 分子的穩定性。另外，統計了三種狀態下巴利昔-Fab 分子的溶劑可及表面積，結果表明，和天然狀態相比較，干燥狀態的巴利昔-Fab由于分子內部塌陷導致表面溶劑可及表面積變化明顯，當添加保護劑時，塌陷得到改善，表面的溶劑可及表面積接近天然狀態。綜上說明蔗糖、甘氨酸和甘露醇更容易占有巴利昔-Fab 分子的表面為蛋白質提供更接近水溶劑的氫鍵環境，從而保護蛋白質結構。

3 討論

本文利用分子動力學方法模擬研究了巴利昔單抗的復合保護劑蔗糖、甘氨酸和甘露醇與蛋白質之間的相互作用關系，并與不添加保護劑的體系相比，可以看出，復合保護劑對巴利昔抗體蛋白有較好的保護作用。結果表明，巴利昔抗體蛋白分子因其具有極高柔性在干燥狀態下會發生較大的形變導致分子變性失活，蔗糖、甘氨酸和甘露醇組成的復合保護劑可以通過氫鍵作用為干燥狀態下的巴利昔單抗分子提供類似于水溶液中的氫鍵環境，改善蛋白分子表面的疏水性質，阻止無規則卷曲結構的形成，從而保護其蛋白質的天然構象不被破壞。分子模擬的方法與實驗篩選相比，不僅快速、直觀，節約時間和研究成本，而且能從理論上闡釋其活性保護的規律，為闡明保護劑的保護效果和作用機制提供基礎。隨著大數據和計算機技術的不斷發展，計算機模擬的方法在凍干制劑保護劑開發中的應用會越來越廣泛。

圖 7 巴利昔-Fab 分子與保護劑的氫鍵統計和包裹巴利昔-Fab 分子的保護劑的溶劑可及表面積

Figure 7 Interaction beween basiliximab-Fab and protectant and solvent accessible surface area of protectants locating near the basiliximab-Fab

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Simulation analysis on the bioactive structural protection of lyoprotectantsin basiliximabby moleculardynamics

YU Xiao-juan, YU Chuan-fei, FANG Sen-biao, WANG Lan

To study the mechanism of sucrose, glycine and mannitol as lyoprotectants in production of basiliximab.

Under condition of 300K system, Gromacs 5.0.5 toolkit was used. The main methods include computer simulation and model building, which were used to simulate three states of basiliximab molecule: natural state, dry state, state adding sucrose, glycine and mannitol as a composite protective agent. Then, the mechanism was analyzed on the basis of comparison of structures.

The results showed that in the dry state, the active structure of basiliximab molecule was obviously collapsed, the region of loop structure was obviously increased, the number of hydrogen bonds was decreased, and the surface electrostatic property was also changed. In the presence of sucrose, glycine and mannitol as a composite protective agent, the above conditions was significantly improved, thus the structural collapse and denaturing inactivation were inhibited by drying and water loss of basiliximab.

Sucrose, glycine and mannitol combined as a composite protective agent can protect the activity of basiliximab lyophilized preparation.

Basiliximab; Bioactive structure; Protective mechanism; Molecular dynamics; Composite protective agent

WANG Lan, Email: wanglan@nifdc.org.cn

國家自然科學基金（21702007）；中國食品藥品檢定研究院中青年發展研究基金（2019B1）

王蘭，Email：wanglan@nifdc.org.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.06.002

Author Affiliations: Division of Monlclonal Antibodies, Institute for Biological Product Control, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 102629, China (YU Xiao-juan, YU Chuan-fei, WANG Lan); State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, School of Pharmacy, Peking University, Beijing 100191, China (YU Xiao-juan); School of Computer Science, Zhongnan University, Changsha 410083, China (FANG Sen-biao)

2020-09-27