HIP-55介導胞內信號轉導的分子機制研究

陳星卉，韓 峰，盧應梅

(1. 南京醫科大學藥學院，心腦血管病重點實驗室，江蘇 南京 211166； 2. 浙江大學城市學院，醫學院，浙江 杭州 310015；3.南京醫科大學基礎醫學院，生理系，江蘇 南京 211166)

MAP4K1(又名HPK1) 作為MAP4K家族的成員，是一種哺乳動物Ste20相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶。它能通過MAP3K轉導信號至MAP2K，從而激活c- Jun N末端激酶(c-JunN-terminal kinase，JNK)。因此，HPK1蛋白能夠將胞外信號從質膜傳遞到細胞核從而調控在哺乳動物細胞的增殖、分化或應激調節等生命功能。HIP-55 (HPK1-interacting protein of 55 ku) 作為與HPK1蛋白相結合的一種接頭蛋白能夠增加MAP4K1和JNK的激酶活性。此外，由于HIP-55具有多蛋白結合結構域，因而主要承擔信號轉導的功能。目前關于HIP-55主要圍繞調節細胞增殖與凋亡、心血管調控、免疫調節與中樞神經調控。本文將以HIP-55蛋白的生物學功能為基礎，重點介紹其胞內的信號轉導通路和該信號參與的病理生理過程調控，為其在信號轉導關聯的臨床疾病研究奠定理論基礎。

1 HIP-55蛋白結構及生物學功能研究

1.1 HIP-55蛋白分布與表達HIP-55是一種含有多種結構域的接頭蛋白，是在1996年由Sparks等[1]首次從含有SH3結構域的蛋白中純化而得，能夠與骨架蛋白F-actin、HPK1相結合的一種新型接頭蛋白，N端與肌動蛋白F-actin相結合的結構域和C端的SH3結構域[2](Fig 1)。HIP-55通過SH3結構域與Synapsin 1、dynamin 1、synaptojanin 1[3]和Fgd1[4]蛋白相結合，在小鼠胚胎時期HIP-55蛋白表達量呈先升后降的趨勢[2]。2006年，Connert等[5]首次應用HIP-55敲除老鼠證實其主要表達于腦、胸腺、脾臟、心臟和肺中。然而，綜合數據庫資料顯示，HIP-55雖普遍存在于人體組織器官，但是在卵巢和肌肉中表達量很少或無表達。細胞水平上表明，HIP-55定位于細胞骨架與細胞膜上。2009年，Goroncy等[6]首次對HIP-55的晶體結構進行解析，并證實ADF-H結構域為長螺旋結構 (Fig 2)。

Fig 1 Schematics of domain structure of HIP-55 proteins

Fig 2 Schematic diagram of HIP-55 protein crystal structure

1.2 HIP-55生物學功能HIP-55蛋白分布廣泛，體內眾多細胞均可表達，因此所行使的生物學功能也多種多樣。已有文獻表明HIP-55能夠抑制心臟成纖維細胞的增殖分化且下調心臟收縮力，調控心血管功能[7]。HIP-55對免疫系統也具有調控作用，已有文獻報道HIP-55調控白細胞粘附能力[8]和吞噬能力[9]。在高速流動血液的條件下，HIP-55對于多型核中性粒細胞(PMN) 從管內外滲及擴散也是至關重要的。此外，HIP-55能夠激活T細胞[10]和B細胞[11]:HIP-55能夠激活T細胞和B細胞的增殖分化能力、細胞因子產生能力、激活能力，還可以促進T細胞形成免疫突觸(immunological synapse，IS) 有利于與抗原遞呈細胞 (antigen-presenting cells，APCs) 相結合，達到激活T細胞的目的[11]。在中樞神經系統中，HIP-55參與到網格蛋白所介導的內吞(clathrin-mediated endocytosis，CME) 過程中[3,12]，保持突觸前膜活動與功能完整性[13]，調控神經元形態[14-15]。Connert等[5]于2006年首次在全敲HIP-55老鼠中發現存在神經系統障礙且神經元突觸的遞質循環受到損傷。

2 HIP-55信號參與生理過程調控的分子機制研究

2.1 HIP-55的磷酸化修飾HIP-55作為酪氨酸激酶的反應底物可以通過Syk、Lyn和Blk磷酸化，從而將信號傳導至構成細胞骨架的蛋白中[9]。Liu等[16]應用質譜聯用磷酸肽富集技術(mass spectrometry combined with phosphopeptide enrichment technique) 系統鑒定哺乳動物細胞中HIP-55蛋白的磷酸化位點。該研究成果為進一步研究不同亞型的HIP-55磷酸化提供了依據，也為進一步研究其在該蛋白參與的信號轉導在生理與病理狀態下的生物學功能提供了參考。

2.2 HIP-55參與調控細胞增殖等生命活動許多蛋白參與細胞內信號轉導從而調控細胞凋亡、增殖、影響細胞周期等生理和生化過程，已有文章報道胞外信號可通過G蛋白偶聯受體TGR5將AKT蛋白激酶B磷酸化，從而影響細胞的生命活動[17]。同樣HIP-55作為一種接頭蛋白也能夠參與到多種信號轉導過程中，調控多條胞內信號通路[2,13]。HIP-55通過胞內信號轉導參與到細胞增殖分化、遷移侵襲及凋亡等生命活動中。蛋白磷酸化是一類常見的翻譯后修飾，在許多細胞生命功能中起重要作用[18-20]。由于HIP-55是酪氨酸激酶的反應底物，HIP-55通過在其酪氨酸位點337和347上磷酸化可以參與不同生理功能的調控:能夠促進細胞足小體(podosome rosette) 的形成進而參與到成纖維細胞轉化過程中[21]；促進胚胎期的神經元由腦室區(ventricular zone，VZ) 或腦室下區(subventricular zone，SVZ) 產生并逐漸向大腦皮層多極遷移[22]；HIP-55絲氨酸位點269磷酸化能夠調控FHL2/HIP-55復合體的活性，進而調控腫瘤細胞的增殖和侵襲[23]。此外，HIP-55還可以通過GTPase參與細胞的生命活動的調控中 (Fig 3):HIP-55通過抑制RhoA家族信號通路轉導，與能夠上調細胞侵襲和RhoA的蛋白FHL2通過N端ADF-H結構域相結合，激活Rho GTPase信號通路協同調控細胞侵襲過程[23]。當細胞受到趨化遷移刺激時，HIP-55通過Rac1蛋白激活誘導F-actin肌動蛋白重排[2]，并且可以使HIP-55快速富集到片狀偽足。在趨化因子刺激時Arp2/3與HIP-55共定位形成動力區域參與到F-actin細胞骨架重排引起片狀偽足的形成[24]。另一方面，HIP-55與GTPase Dynamin相互作用也可以參與到細胞內吞及膜轉運過程[3]。HIP-55作為肌動蛋白結合蛋白，能夠被凋亡狀態細胞的Caspase裂解從而引起細胞骨架和形態的改變參與細胞凋亡過程中。

Fig 3 Participation of HIP-55 in regulation of cell activities through GTPase

2.3 HIP-55參與免疫系統調控HIP-55作為HPK1/JNK信號通路的上游激活蛋白，可以和HPK1結合抑制由T細胞受體(TCR) 激活誘導產生的細胞因子上調。當TCR激活后發現JNK和HPK1活性降低，并且在HIP-55敲除的T細胞中發現TCR激活功能發生損傷，p38蛋白的磷酸化也相應下調[16]。同時TCR激活后，HIP-55能夠與HPK1結合并將其復合體轉運至T細胞與抗原遞呈細胞(APC) 接觸位置[25]，證明TCR激活過程中需要HIP-55調控的HPK1/JNK信號通路參與(Fig 4)。對于B細胞受體(BCR)，HIP-55同樣通過招募B細胞抑制性因子HPK1到達BCR上從而削弱B細胞活性[11]。白細胞從血液流向發炎組織的遷移粘附能力受到整合素調控，是免疫應答產生的關鍵，而β2整合素(CD11/CD18) 的激活對于白細胞從高速流動的血液中捕獲到粘附在血管內壁是至關重要的。2009年，Barbara Walzog實驗室利用全敲HIP-55老鼠發現在全敲老鼠體內的HIP-55缺失引起β2整合素(CD11/CD18) 數量下調[8]，提示HIP-55作為接頭蛋白可參與由β2整合素調控的免疫細胞的粘附作用影響白細胞生命活動。該研究團隊進一步發現HIP-55通過肌動蛋白的調控參與到β2整合素介導的白細胞吞噬過程中[9]。

Fig 4 T cell activation regulated by Hip -55 through HPK1/JNK signaling pathway

2.4 HIP-55與神經突觸功能調控在中樞神經系統中，神經信號傳遞由突觸囊泡釋放神經遞質開始，之后突觸前膜回收已釋放神經遞質的突觸囊泡以維持整體突觸的結構及功能完整性。已有研究表明HIP-55可以調控神經遞質囊泡回收過程，其機制是HIP-55的SH3結構域與GTPase Dynamin的結合參與由網格蛋白包被囊泡及網格蛋白所介導的內吞(clathrin-mediated endocytosis，CME)過程[3,12]。另一方面，突觸前活性區的重要組成蛋白Piccolo能夠和HIP-55結合參與神經遞質在突觸前活動區鄰近位置的內吞過程，支持突觸前的活動與功能完整性[13]。此外，肌動蛋白對于神經元的骨架重排非常重要，HIP-55作為與肌動蛋白相結合的接頭蛋白，可以通過RhoA家族蛋白Cdc42調節細胞骨架重排調節生長錐(Growth Cone)[4]。具體機制為:Fgd1直接與Cortactin和HIP-55在細胞骨架上結合，通過特異性激活Cdc42進一步上調N-WASP和Arp2/3復合體活性，促使偽足的形成 (Fig 5)。在早期發育的神經元中敲低HIP-55能夠正向調控軸突長度[24]和樹突棘長度[14]，然而SH3結構域過表達后下調樹突棘及蘑菇型樹突棘的密度[14]。另有報道證實HIP-55能夠與抑制小腦浦肯野細胞分化的Cobl蛋白結合，協同下調細胞樹突分枝點數量及樹突分支密度[15]。

Fig 5 Cytoskeleton arrangement regulated by HIP-55

3 HIP-55信號參與病理過程調控的分子機制研究

3.1 HIP-55參與腫瘤細胞凋亡過程HIP-55可以通過HPK1/JNK通路促進腫瘤細胞增殖[23]，當過表達HIP-55能夠降低HPK1的活性激活腫瘤分化能力[23,26]。另一條促進腫瘤細胞增殖存活的機制是HIP-55通過AKT激酶的調控與14-3-3形成穩定的復合物[27]，從而下調腫瘤細胞凋亡能力。此外，通過對已發表數據庫進行篩選，發現HIP-55在宮頸癌和胰腺癌患者中高度表達[28]，揭示HIP-55可能作為一種潛在的檢測腫瘤細胞的指標蛋白。在癌癥患者中，HIP-55在十二種腫瘤組織中均有上調，這些數據提示當HIP-55過表達誘發腫瘤細胞的生成。此外，Yang等[26]利用HIP-55敲低的A549肺癌細胞系，用微陣列法分析證實HIP-55參與腫瘤細胞的存活，下調由依托泊苷(etoposide) 引起的腫瘤細胞凋亡過程。

3.2 HIP-55與心力衰竭相關的心肌功能調控心力衰竭往往導致心肌組織重構，而心肌纖維化是心肌組織重構過程中的關鍵步驟。β-腎上腺素能受體 (β-adrenergic receptors，β-ARs) 能夠引起心肌纖維化， ERK1/2 MAPK信號通路是β-ARs介導心臟成纖維細胞增殖的重要途徑，當在心臟成纖維細胞中過表達HIP-55之后，由β-腎上腺素能受體激動劑異丙腎上腺素(ISO) 誘導的ERK1/2磷酸化程度下調。且在成纖維細胞中當HIP-55過表達時能抑制p38磷酸化和激酶活性，進一步揭示HIP-55通過下調p38 MAPK通路抑制ISO引起的成纖維細胞增殖[29]。此外，心肌收縮力對保持正常血流輸出量和心臟正常功能至關重要，當HIP-55敲低時能夠激活心臟收縮力，其機制是HIP-55通過肌動蛋白結合對心臟收縮力進行調控。

4 總結與展望

目前關于HIP- 55的研究主要從其蛋白結構特性入手，針對其能夠與多種蛋白相互作用并且參與多種信號轉導(Tab 1)，從而發現信號轉導異常所引起的病理現象。越來越多的研究表明，HIP-55對免疫應答、心血管系統調控、細胞的增殖與凋亡以及神經功能調節等方面起著重要作用，具有廣泛的生物學效應。由于在腫瘤患者的組織中檢測到高表達的HIP-55，因此可以作為一種潛在的檢測腫瘤細胞增殖的指標蛋白。然而，關于HIP-55的亞細胞定位、動物整體水平HIP-55的缺失導致的發育功能障礙以及器官形態變化的機制尚未揭示，并且對于HIP-55突變或者其信號轉導異常關聯的臨床疾病相關資料報道尚少。因此，隨著對HIP-55及其介導的信號通路深入研究，有助于深入理解細胞骨架運動和細胞凋亡過程等調控機制。鑒于HIP-55是一種由受體介導的接頭蛋白，開發HIP-55作為一種新型藥物靶標以及對其參與的信號轉導途徑的轉化醫學研究更具意義。

Tab 1 HIP-55 interacting proteins in mammals