雞球蟲病疫苗稀釋劑配方的初步篩選

武一帆，范炳靈，郭露露，馬曉蘭，趙 彤，鄭明學(xué)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

雞球蟲病是一種危害嚴(yán)重的寄生蟲疾病，在養(yǎng)殖場內(nèi)非常多見，每年因球蟲病造成的直接經(jīng)濟損失和用于預(yù)防球蟲病的藥物、疫苗等間接費用巨大，據(jù)統(tǒng)計，全世界因該病而引起的損失每年超過30億美元[1]。即使大型養(yǎng)殖場在飼養(yǎng)管理、飼料營養(yǎng)等方面有了很大的改善和提高，但是仍然不能杜絕球蟲病的發(fā)生。因此，長期飼養(yǎng)的雞一般都會使用雞球蟲病的疫苗來免疫預(yù)防球蟲病。

在臨床實際中，常用的雞球蟲病疫苗均為活卵囊疫苗，主要有灌口、飲水、拌料和噴霧等多種免疫方法[2]。其中，灌口接種法操作較為繁瑣，應(yīng)激大；飲水免疫法需要特殊的助懸劑，雛雞日齡小飲水量不夠，無法保證免疫效果；拌料免疫法是手工操作，容易出現(xiàn)拌不勻或個體食量差異問題，造成免疫不均；噴霧免疫法是近幾年才出現(xiàn)的一種免疫方法，它能大幅度降低人力物力，適合于大型的雞場，但用水作為稀釋劑噴出的霧滴，容易滾落到地上，造成卵囊的損耗，同時水滴易干，疫苗在干燥的空氣中失去活性，也會降低雞的免疫效果。ALBANESE等[3]采用凝膠稀釋劑稀釋疫苗，能讓更多的疫苗液滴黏附在雞羽毛上而不易掉落，從而使雞有更多時間進(jìn)行整理和攝取卵囊。但國內(nèi)在本研究領(lǐng)域暫無文獻(xiàn)報道。因此，本研究基于雞球蟲病疫苗的特性、雞自然特性及免疫途徑多方面因素考慮，尋找一種具有助懸效果，可以均勻攜帶球蟲卵囊及大量水分并黏附于雞只體表，即集黏度、保濕、生物安全和可食用性于一體的材料用作疫苗稀釋劑。

黃原膠是一種高分子量多糖，是目前國際上集增稠、懸浮、穩(wěn)定、乳化于一體，性能優(yōu)越的生物膠，無臭、無味、無毒、生物安全，廣泛應(yīng)用于藥物和食品領(lǐng)域。同時它是典型的非牛頓流體，其水溶液具有極高的假塑性[4]，有利于噴霧液滴的形成。石點等[5]研究結(jié)果表明，1%的黃原膠黏度大約為2 500 mPa·s。

海藻酸鈉是從褐藻類的海帶或馬尾藻中提取的一種多糖碳水化合物，具有優(yōu)良的穩(wěn)定性、成膜性、抗菌性、無毒無味、可生物降解、生物相容性好等諸多優(yōu)點，且成本較低，可作為可食膜材料，用于黏附給藥途徑的生物制劑和疫苗蛋白多肽的藥物載體[6-8]。劉曉靜等[9]研究表明，1.0%的海藻酸鈉處理在抑制蓮藕表皮褐變方面效果良好，經(jīng)0.8%、1.0%、1.2%濃度涂膜處理后的蓮藕失重率分別為7.5%、2.0%、4.5%。羅海莉[10]研究表明，海藻酸鈉濃度越高，膜厚度越大，透光率越低，其中，2%海藻酸鈉成膜性最佳。于子森等[11]研究表明，1%的黏度在300～350 mPa·s，2%的黏度在2 000～3 000 mPa·s，3%的黏度在15 000～20 000 mPa·s。咸娜[12]研究指出，黃原膠和海藻酸鈉復(fù)配具有協(xié)同性，溶液的黏彈性大于單體膠，0.5%的黃原膠和海藻酸鈉復(fù)配9∶1時黏度最高，在800～1 000 mPa·s；1%的黃原膠和海藻酸鈉復(fù)配4∶6黏度最高，在3 000～3 500 mPa·s。英特維特國際股份有限公司[13]發(fā)明的一種可用常規(guī)噴霧裝置進(jìn)行噴霧的球蟲疫苗專利，表明200～4 000 mPa·s黏度含黃原膠成分的溶液噴霧時更容易形成不會打濕雞只羽毛的小液滴。

甘油作為一種親水性材料，無色、略帶甜味、無臭、透明，它能輕易地插入多糖分子鏈，并和分子鏈上的親水基團結(jié)合形成氫鍵。當(dāng)親水性的甘油各分子參與成鍵作用成功，多糖膜在分子內(nèi)或分子間本身的相互作用能力就會大大地減弱，因此，多糖膜結(jié)構(gòu)的剛性被削弱，其膜的柔韌性增加，故達(dá)到了改善多糖膜機械和化學(xué)性能的目的，使多糖膜變得柔軟、有光澤并且富有彈性[14-15]。羅海莉[10]在試驗中添加了1%的甘油作為增塑劑，有效地改善了海藻酸鈉的成膜性。鄭長興[16]研究指出，在蒸餾水中加入5%的甘油能有效防止噴出的霧滴迅速被蒸發(fā)掉。

本試驗以黃原膠、海藻酸鈉為主要原料，以甘油為增塑劑、保濕劑，通過正交試驗設(shè)計不同配方，測定黏度、黏壁率、沉降率、失水率等指標(biāo)，同時結(jié)合臨床實際應(yīng)用及生產(chǎn)成本選出懸浮穩(wěn)定性合格、霧滴持水性好、黏壁率高、價格低廉的最優(yōu)配方，旨在為球蟲噴霧免疫研究提供合理參數(shù)及配方。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要原料 黃原膠，食品級，鄂爾多斯市中軒生化股份有限公司；海藻酸鈉，食品級，青島明月海藻集團有限公司；丙三醇，分析純，天津易發(fā)化學(xué)試劑廠。

1.1.2 蟲株 雞堆型艾美耳球蟲（Asx）由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院獸醫(yī)病理實驗室保存并提供。

1.1.3 主要儀器設(shè)備NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）、離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）、恒溫箱（上海博迅實業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 配方設(shè)計 混合使用黃原膠、海藻酸鈉、甘油濃度3種成分，設(shè)置黃原膠（因素A）3個水平，分別為0.4%、0.6%、0.8%；海藻酸鈉（因素B）3個水平，分別為0、0.1%、0.6%；甘油（因素C）3個水平，分別為0、1%、5%。按照表1疫苗稀釋劑配方進(jìn)行L9（34）正交試驗設(shè)計。

表1 正交試驗設(shè)計

1.2.2 疫苗稀釋劑的制備 分別取100 mL去離子水依次加入到9個干燥潔凈的小燒杯中，按表1對應(yīng)加入甘油，備用。取9個小玻璃瓶，按表1稱取各處理物質(zhì)，用錫紙密封，搖晃混勻，再用牙簽在錫紙上均勻地扎6個小孔，將小玻璃瓶中原料撒入對應(yīng)的小燒杯中，邊加邊用玻璃棒攪拌，靜置1～2 h，使溶液均勻一致接近無色透明（肉眼不可見顆粒），然后分別以2 000 r/min離心5 min，取出倒回?zé)谩?/p>

1.3 測定項目及方法

1.3.1 黏度測定 采用NDJ-1型旋轉(zhuǎn)黏度計進(jìn)行測定，記錄3號轉(zhuǎn)子、30 r/min下各處理的黏度。

1.3.2 黏壁率測定 取9個100 mL小燒杯，編號T1～T9，稱質(zhì)量（A），并記錄；然后取9個處理球蟲疫苗噴霧免疫稀釋液于對應(yīng)的燒杯中，稱質(zhì)量（B），并記錄。稱量完成后將燒杯內(nèi)液體垂直傾倒出，待到液體斷流，收起燒杯，稱量傾倒后燒杯的質(zhì)量（C），并記錄。

1.3.3 失水率測定 取9個規(guī)格相同潔凈干燥的平皿，編號T1～T9。稱取20 g各處理疫苗稀釋液于不同的平皿中，稱質(zhì)量（W0），并記錄。稱量完成后將上述平皿置于33℃恒溫箱中，于放置后1、6、12、24、48、72 h稱質(zhì)量（Wt），并記錄。

1.3.4 沉降率測定 取9只10 mL離心管，分別加入1 mL（50 000個/mL）球蟲卵囊液，2 500 r/min離心10 min，棄上清，用玻璃棒攪勻沉淀；沉淀攪開后，分別加入各處理球蟲疫苗稀釋劑10 mL，從不同方向（順時針、逆時針、上下）反復(fù)攪拌，使球蟲卵囊在稀釋液內(nèi)均勻分布；于配制球蟲疫苗混懸液后的0、4、8 h，用移液槍在10 mL離心管上、中、下3層分別吸取10μL球蟲疫苗混懸液，在10×10顯微鏡下計算卵囊數(shù)，每處理各取樣3次，取平均值，以0 h混懸液的卵囊平均數(shù)為基數(shù)。若8 h的球蟲沉降率小于10%，表明卵囊既不上浮也不沉降，符合混懸要求。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行處理，以“K值＋R值”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏度分析

從圖1可以看出，黏度值整體呈上升趨勢。由表2可知，黃原膠的黏度值K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1；海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1；甘油的K值大小表現(xiàn)為K2＞K3＞K1，表明稀釋劑黏度隨著膠體成分濃度的增加而增加，其中，對黏度值影響最大的是黃原膠（極差R為0.897），其次依次是海藻酸鈉（極差R為0.307）和甘油（極差R為0.097）。

表2 黏度K值和極差R

2.2 黏壁率分析

從圖2可以看出，黏壁率整體呈上升趨勢。從表3可以看出，黃原膠黏度率的K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1，海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K3＞K2＞K1，甘油的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，因此，黏壁率的最優(yōu)水平組合是A3B3C1；其中，對黏壁率影響較大的是黃原膠（極差R為12.663），其次依次是海藻酸鈉（極差R為4.217）和甘油（極差R為0.250）。

表3 黏壁率K值和極差R值

2.3 失水率分析

不同處理12 h之前的失水率無明顯差別，12 h后不同處理各時間段以T7處理失水率最低，表現(xiàn)出明顯優(yōu)勢（表4）。不同處理1 h時的失水速率差異明顯，T7處理的失水速率最低，12 h后不同處理失水速率變化均不明顯（表5）。黃原膠失水率的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K1＞K3＞K2，甘油的K值大小表現(xiàn)為K2＞K1＞K3，因此，失水率的最優(yōu)水平組合是A3B2C3；其中，對失水率影響較大的是甘油（極差R為10.667），其次依次是黃原膠（極差R為4.000）和海藻酸鈉（極差R為3.167）（表6）。

表4 各時間段各組失水率 %

表5 各時間段各組失水速率 g/h

表6 失水率K值和極差R值

2.4 沉降率分析

表7 沉降率試驗結(jié)果

表8 沉降率K值和極差R值

T3～T9處理8 h的沉降率均小于10%，表明卵囊既不上浮也不沉降，符合混懸要求（表7）。黃原膠沉降度的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，海藻酸鈉的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，甘油的K值大小表現(xiàn)為K1＞K2＞K3，因此，沉降率的最優(yōu)水平組合是A3B3C3；其中，對沉降率影響較大的是黃原膠（極差R為10.883），其次是海藻酸鈉（極差R為5.100），再次是甘油（極差R為4.817）（表8）。

3 結(jié)論與討論

本研究通過對黏度及黏壁率試驗結(jié)果分析可知，膠體濃度升高，黏度升高、其黏壁率也升高；而甘油的濃度與黏度及黏壁率間無明顯變化規(guī)律。姚云真等[14]研究了不同濃度甘油對不同種明膠溶液黏度的影響，結(jié)果顯示，并非甘油濃度越高黏度越高；王利強等[17]研究表明，甘油濃度的增加會使總成膜液的黏度上升，0的甘油黏度度量值為10.01，1%為13.48，2%為13.24，可以看出，2%的黏度度量值比1%的低，與本試驗研究結(jié)果相符。甘油濃度與黏度間的變化規(guī)律性還有待進(jìn)一步研究。

本研究失水率試驗結(jié)果顯示，甘油對失水率的影響最大，其保濕原理是由于其含有3個羥基（丙三醇），易親水，能吸收空氣中的水分，還可以防止水分蒸發(fā)，因此，具有良好的保水性[18]。黏壁率、失水率、沉降率最優(yōu)組合分別為A3B3C1、A3B2C3、A3B3C3，可以發(fā)現(xiàn)，黃原膠可選水平為A3，海藻酸鈉可選水平為B2和B3，甘油的可選水平為C1和C3。黃原膠作為影響?zhàn)け诼省⒊两德实闹饕蛩兀瑑?yōu)選時應(yīng)該選擇更高濃度的水平以提高黏度，但考慮到原料的成本問題和噴霧儀器的配適問題，選擇達(dá)到混懸效果的低用量處理即可，故A2也是黃原膠的可選水平。綜上，黃原膠、海藻酸鈉和甘油以A2B1C3的組合為宜。

有研究表明，黃原膠主要與魔芋膠的復(fù)配效果較好[19]。王元蘭等[20]研究表明，黃原膠和魔芋膠以不同比例復(fù)配均有明顯的協(xié)同作用。因此，在后續(xù)的研究中，黃原膠和魔芋膠復(fù)配的組方還有待深入探討。