中國白酒釀造微生態學研究技術進展及應用狀況

高占爭，張文學，吳正云

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川成都 610065；2.四川水井坊股份有限公司，四川成都 610037）

1 白酒微生態學的簡介

微生物生態學認為，微生態系統是在一定的時間空間內微生物種群之間，以及它們與生境之間，不斷地進行物質循環、能量流動和信息傳遞而形成的統一整體。而中國白酒釀造系統中的大曲、窖泥、糟醅及釀造環境都是一個微生態系統，而這些小的微生態系統又構成了白酒釀造微生態系統。由此，國內專家學者開始以微生態學的觀點來研究白酒釀造微生態系統。四川大學的張文學教授等[1-2]結合微生態學和白酒釀造的特點，把白酒釀造微生態學定義為：研究白酒釀造過程中微生物菌群與微觀釀造環境之間相互關系的科學；研究內容包括白酒制曲、窖池、酒醅和發酵環境中的微生物菌群以及微觀環境之間的相互關系。白酒釀造微生態的概念提出后，很快得到了行業內專家學者的認同，同時白酒釀造微生態學也得到了快速發展。根據SCI 收錄的關于白酒微生物多樣性的文章可以明顯看出這種趨勢，2007年到2010 年每年只有一篇文章，2011 年到2013 年每年有4～6 篇文章，而2014 年有14 篇，2015 年有12 篇，2016 年1～6 月已有6 篇文章。其中，早期的論文多數都是張文學教授團隊的研究。除了白酒領域之外，張文學教授團隊還把釀造微生態的研究引領到泡菜等其他發酵食品領域，促進了中國各類特色釀造發酵食品微生態學的發展。白酒釀造微生態學的快速發展離不開研究技術的支撐，特別是新的分子生物學技術層出不窮，有力地促進了白酒釀造微生態學的快速發展，在上面這些研究白酒釀造微生態的文章中，多數使用了分子生物學技術。因此有必要了解釀造微生態學研究技術的優缺點、應用現狀和發展狀況，以便促進白酒釀造微生態學的進一步發展，更有利于認識白酒釀造規律，促進白酒生產技術的改進。

2 中國古代及近現代對釀酒微生態的認識

中國的釀酒文化源遠流長，在古代人們認為釀酒是神秘的現象，對釀酒微生物幾乎沒有科學的認識，但我國人民在長期的生產實踐中不斷地摸索、探索，在不知不覺中運用生態學的原理及方法進行釀酒。例如，我們自古以來就非常重視釀酒地理及生態環境，例如必須考慮釀酒當地的氣候、土壤、水質等因素。

用曲釀酒，是我國祖先在釀酒科技史上的一大發明，是中國釀酒工藝獨一無二的特點。曲藥釀酒技術就體現了人們對釀酒微生態的一些初步認識。在《齊民要術·造神曲并酒》[3]中記載：“造酒法：……一斗曲用水一斗五升，十月桑落，初凍，則收水釀者為上時春酒；正月晦日收水，為中時春酒；初凍后，盡年暮，水脈既定，收取則用。其春酒及余月，皆須煮水為五沸湯，待冷，浸曲。不然則動?！边@段話體現的是中國黃酒傳統釀造的技術措施之一，巧妙地利用了氣溫的變化和熱水殺菌。冬季氣溫低，雜菌少，燒水也可以殺滅雜菌，這都有利于釀酒功能微生物群落的生長繁殖，有利于釀造優質酒。對微生態的認識在制曲方面也有體現，例如選擇制曲原料不必墨守陳規，可以因地制宜，制曲季節要適時，踩曲松緊度要適度，曲坯包裹要嚴密、要注意通風保溫等等。這都是為了富集有益微生物群落，盡量減少雜菌。

3 白酒釀造微生態研究的近現代技術

中國雖然釀酒歷史悠久，在早期對釀造微生態也有一些初步認識，但是對釀造微生態真正的認識和利用還是從近代科學技術的出現開始的。

隨著荷蘭人Leeuwenhoek 發明制造出顯微鏡，直接觀察到微生物的形態，人們對微生物首次有了直接的認識。1910 年又一里程碑技術——微生物平板純培養技術的出現，把微生物技術推向一個新高度，有力地促進了微生物學的發展[1]。后來抗生素的出現、無菌動物飼養和厭氧技術的發展促使微生物學和相關技術的快速發展，也促使微生態學作為生態學的一個學科分支出現。

這一時期主要應用顯微鏡和微生物平板純培養法研究釀酒微生物。微生物平板純培養法[4]是根據特定的，具有明顯特點的微生物選擇相應的培養基，分離進行純培養，對純種微生物通過顯微鏡觀察形態，然后再根據生理生化特征等方面進行分析鑒定。這是傳統的微生物多樣性研究方法，只適用于可培養微生物，微生物態中還有絕大部分的未培養微生物，因此無法真正了解微生態的整體。

我國對釀酒微生態的認識也是隨著這些技術的發展逐步深入的。1931 年，我國黃?；瘜W工業研究社查明了各地高粱曲中的微生物[3]，首次分離出多種絲狀真菌和酵母，主要有華根霉、東京根霉、李克犁頭霉、魯氏酵母、釀酒酵母等。這一研究促進了人們對大曲微生物的科學認識和利用。解放后我國加大了對白酒的研究力度，分離出很多純種微生物，例如大曲中的紅曲霉、窖泥中的己酸菌等[5]。這一時期主要是利用微生物純培養技術分離出釀酒主要菌種，然后再研究利用這些菌種提高原料利用率、岀酒率等。中國白酒釀造環境中微生物種類豐富，種群復雜，傳統的平板純培養技術無法分離和分析更多的微生物，更無法研究釀酒微生物菌群之間的相互作用。所以這一時期注重的是單個微生物的分離、培養和應用，雖然對釀酒微生物和釀酒環境有了更深入的認識，但受技術條件限制無法充分認識和利用釀酒微生態。

4 近年白酒微生態學研究技術的發展及應用

近年來分子生物學相關技術的快速發展有力地促進了白酒微生態學和研究技術的發展。目前白酒微生態學研究中除傳統的微生物分析方法外，還用到一些生態學研究常用技術，例如磷脂脂肪酸分析方法（PLFA），而用到的最主要的技術為分子生物學技術，如基于PCR 的指紋圖譜分析、基因測序及系統發育分析、克隆文庫、熒光原位雜交技術（FISH）、宏基因組學、蛋白組學、代謝組學等。

4.1 基于PCR 的指紋圖譜分析技術

現在白酒釀造微生態研究中最常用的技術就是基于PCR 的指紋圖譜分析技術，主要有DGGE（變性梯度凝膠電泳，Denaturing gradient gel electrophoresis）、SSCP（單鏈構象多態性，Single strand conformation polymorphism）、RFLP（限制性片段長度多態性，Restriction fragment length polymorphism）等。在這些技術中使用最多的是PCR-DGGE 技術，此外DGGE 分析技術還可以與實時定量PCR（quantitative real-time PCR）、DNA 芯片、巢式PCR（Nested PCR）等技術相結合分析白酒釀造微生物的多樣性。

PCR-DGGE 技術[6-7]首先分離純化環境樣品DNA，再用通用引物PCR 擴增核糖體核糖核酸的部分序列，原核生物一般是16S rRNA/16S rDNA 的V3、V4、V5 區，真核生物18S rRNA/18S rDNA 的V4 區以及ITS 序列，然后進行DGGE 分析。再通過DGGE 優勢條帶的切膠回收、測序、鑒定，獲取微生物種群結構信息。

在白酒釀造微生態的研究中，以PCR-DGGE技術為主并結合其他技術在窖泥、糟醅、大曲的微生物多樣性研究中均有廣泛應用。Liang 等[8]為了區分成熟窖泥和退化窖泥，用PCR-DGGE 和qPCR技術比較分析不同地區中國濃香型白酒成熟窖泥與退化窖泥中細菌群落。此作者還用同樣的技術分析了新窖泥和成熟窖泥的細菌群落結構[9]。Liu等[10]用DGGE 技術分析了中國濃香型白酒窖泥（窖齡分別為1 年、50 年、100 年、400 年）中梭菌I 的多樣性。Deng 等[11]用PCR-DGGE 方法分析不同窖齡窖泥微生物群落。Ding 等[12]用PCR-DGGE 與FISH 結合分析人工窖泥中的古細菌和真細菌群落特征。Wang 等[13-14]從不同大曲中提取DNA 用于PCR 擴增，使用16S rRNA,26S rRNA 和18S rRNA的通用引物，擴增后分別用DGGE 方法分析，研究了清香型大曲的微生物多樣性。Xiong 等[15]用PCR-DGGE 方法系統研究了3 種大曲（機制大曲、手工、混合制曲）中細菌、芽孢桿菌、真菌、酵母群落。Du 等[16]用PCR 擴增放線菌rDNA，然后用DGGE 方法分析了大曲培養過程中鏈霉菌的生態情況，結果表明，大曲培養過程中鏈霉菌廣泛存在。

之所以基于PCR 的DGGE 應用這么廣泛，是因為其有突出優點[17-18]：可以快速、簡便通過DGGE 圖譜來檢測和鑒定微生物種類。但是還有一些技術缺陷，需要進一步改進[17-18]，主要缺陷有：①檢出信息量低，難以建立系統發育樹；② 很難檢出微生物總量低的微生物(＜1%)；③有共遷移現象，而且影響結果的因素比較多，例如DNA 提取分離效果、凝膠濃度、PCR 擴增效率、電泳時間等。

針對PCR-DGGE 的一些弱點，也有改進的方法，例如NestedPCR-DGGE[17]，通過特殊引物的兩次擴增，既增加了檢測的靈敏性，又增加了檢測的可靠性。Wang 等[19]從3 個發酵糟醅和12 個環境因子中提取總DNA，包括糟醅、大曲、窖泥、土壤、空氣、高粱，然后擴增16S 和18S rRNA 基因，用Nested PCR-DGGE 分析典型微生物的分布。同時用16S rRNA 和內轉錄間隔區（ITS）的qPCR 擴增評估樣品中微生物豐度。Ding 等[20]用NestedPCR-DGGE 方法調查和比較了濃香型白酒窖池窖壁和窖底窖泥中古細菌和真菌群落結構。Zhang 等[21]用NestedPCR-DGGE 分析大曲微生物群落特征。

除了使用PCR-DGGE 技術，還有一些研究者利用基于PCR 指紋圖譜分析的其他技術，例如Chen 等[22]優化了PCR-SSCP 分析條件，然后用于濃香型白酒發酵微生物多樣性分析。Hai 等[23]利用PCR-SSCP研究河套酒大曲細菌群落特征。Liu等[24]用實時定量PCR 研究了中國濃香型白酒窖泥中Syntrophomonadaceae 類菌的發展現狀，研究結果表明，此方法快速、靈活、準確，針對性強、靈敏度高。定量結果可以進一步了解Syntrophomonadaceae 在窖泥中不同時間和空間的分布。Wei 等[25]用熒光實時PCR 定量不同窖齡窖泥（3 年、13 年、25年）中的微生物的數量。

4.2 基因測序分析及克隆文庫技術

DNA 序列分析方法是利用已有的許多功能基因及專門的rDNA 序列數據庫軟件，進行序列比較，揭示更高水平的多態性。大多數DNA 多樣性的研究以核糖體RNA（rRNA）或其編碼基因rDNA為對象，利用其中的16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息的保守區和變異區，區分微生物種差異[1，26，27]。

在白酒的微生態研究中也主要是利用16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列信息進行微生物多樣性研究。例如王濤等[28]基于16S rRNA 的基因序列分析研究了宜賓地區濃香型大曲酒釀造過程中可培養細菌系統發育多樣性。Zhang 等[29]用DGGE 方法和18S rRNA 基因分析方法研究分析了中國濃香型白酒釀造過程中糟醅的真菌群落。Chen 等[22]用PCR 擴增的片段為16S rDNA 的V3 區研究發酵糟醅的微生物群落。Liang 等[30]用基于16S rRNA 基因的V3 區鑒定大曲中細菌。Zheng等[31]分析16S rDNA 的V9 區，研究大曲制曲過程中芽孢桿菌群落。Deng 等[11]分析16S rDNA 的v6 到V8 區，研究不同時期濃香型酒窖池窖泥的微生物群落。除了以上對16S rRNA/rDNA 或18S rRNA/rDNA 序列分析研究，還有專家學者利用其他的一些基因序列進行微生物多樣性的研究。Sun 等[32]分析26S rDNA D1/D2 分區的序列，對茅臺酒不同釀造階段的酵母進行鑒定。Xiang 等[33-34]基于SSU rRNA 免培養技術，研究了中國濃香型酒釀造過程中發酵糟微生物群落的演替。

克隆文庫技術是以PCR 技術為基礎，并與基因測序技術相結合，經常用于環境微生態的研究。其基本過程[35-37]是先提取樣本DNA，然后用通用引物進行PCR 擴增，回收純化擴增產物、構建克隆文庫、測序分析、構建系統發育樹，最后推測復雜環境微生物群落的分類學地位。此技術在白酒微生態研究中也有較多使用。例如陳玲等[35]用16S rDNA 克隆文庫法和高通量測序法，分析了濃香型白酒大曲中細菌微生物群落的組成，并通過豐度和多樣性分析，比較了兩種方法在研究大曲樣品細菌多樣性方面的適用性。Zheng 等[38]利用16S rRNA 和26S rRNA 基因克隆文庫分析不同大曲中微生物群落特征。王濤等[39]利用16S rRNA 基因克隆文庫，分析了濃香型白酒窖泥、出窖糟醅的細菌區系的相似性。王明躍等[40]用PCR-ARDRA和16S rRNA 基因克隆測序技術，對四川和安徽產區窖泥細菌和古菌進行了研究。克隆文庫技術，技術成熟，可操作性好。但其操作步驟較為繁瑣，工作量較大，反映總體微生物信息有限，并有可能在一定程度上高估物種豐度及低估微生物群落大小和多樣性。但如果主要以優勢菌群的認識研究為主，不看重極低豐度菌群的存在，不失為一種很好的釀造微生態學研究方法。

4.3 磷脂脂肪酸分析方法（PLFA）及熒光原位雜交技術（FISH）

磷脂脂肪酸分析方法[41-42]是基于細胞中磷脂類化合物相對穩定作為微生物生物量指標，磷脂類化合物中脂肪酸組成特異性和多態性能反映環境中微生物群落結構的多樣性。此方法能夠依靠脂肪酸譜圖定量描述整個微生物群落,是一種快捷、可靠的檢測方法，但它不能在菌種和菌株的水平鑒別出微生物的種類。此外，微生物在不同的生長時期以及環境壓力下的磷脂脂肪酸的含量會有所變化，也會給監測帶來困難。

磷脂脂肪酸分析方法是生態學研究中的一種常用方法，近年在白酒微生態研究中也有較多應用。Zhang 等[43]用PLFA 方法分析3 種汾酒大曲的微生物群落，此方法可潛在用于各種曲的代表性生物標記。Zheng 等[44]利用非培養技術（PLFA、DGGE）對兩個不同廠（劍南春和豐谷）糟醅的不同糟層（上、中、下層）細菌群落的空間分布進行研究。Wu 等[45]用PLFA 方法分析大曲微生物群落特征。Zhao 等[46]用磷脂脂肪酸分析方法研究了不同窖齡窖池窖泥的菌群落結構。

熒光原位雜交技術[47-48]是dsDNA 變性后和帶有互補序列的同源單鏈褪火配對形成雙鏈DNA 或DNA/RNA 異質雙鏈結構的過程，利用熒光標記的探針探測同源核酸序列。熒光原位雜交技術能夠同時對微生物進行定性、定量和其群落結構進行研究，操作容易、安全、檢測迅速，己廣泛用于研究環境微生態和食品微生態。目前有人也開始用此技術研究白酒微生態，例如吳冬梅等[49]利用熒光原位雜交(FISH)技術，研究了窖泥微生物群落結構特征。Ding 等[12]結合PCR-DGGE 和熒光原位雜交(FISH)技術研究了濃香白酒窖池古生菌和真菌群落結構特征。

5 白酒釀造微生態研究的新技術

分子生物學快速發展，新技術不斷涌現，例如新一代測序技術（高通量測序技術）、基因芯片技術、宏基因組學技術、生物信息學技術、代謝組學技術、蛋白質組學技術等。宏基因組學是以新一代測序和基因芯片技術為基礎的，已經是比較成熟的組學技術，在環境微生物學研究中已有較廣泛應用，在白酒釀造微生態學研究中也開始使用。其他的一些新技術雖然不夠成熟，但隨著這些技術的不斷完善，將來肯定會成為白酒釀造微生態學研究中的重要常用技術。因此進一步了解這些新技術的發展狀況，對白酒釀造微生態將來的發展非常重要。

宏基因組學[50]是指不依賴分離培養技術，直接分析菌群中微生物基因組序列和功能的方法。鑒于自然環境中約有99%的至今尚不能培養且一無所知的微生物存在，利用宏基因組學技術可以獲得比培養方法多得多的遺傳信息，為研究非培養微生物提供了有效手段。宏基因組學技術的基本步驟[51-52]是首先直接抽提環境微生物DNA，然后將DNA 片段克隆、轉化，構建宏基因文庫。利用高通量測序技術對文庫進行隨機DNA 序列測定，研究微生物群落組成，尋找特定的功能基因或表達的特殊表型。近年來，宏基因組學已逐漸成為微生物多樣性研究的重要工具之一。

生物信息學技術的發展以及新一代測序技術有利地促進了宏基因組學技術的發展和完善。被稱為深度測序技術(deep sequencing)的新一代測序技術（next generation sequencing，NGS）[53-56]，包括第二代及第三代測序技術，并且開始出現了第四代測序技術。目前第二代測序技術應用較為成熟，該技術基于聚合反應和連接反應，同時對大量DNA 分子平行測序，代表性平臺有454 焦磷酸測序系統（Roche）、SOL iD 平臺（Life Technologies）、Solexa 平臺（Illumina）。第三代測序技術克服了二代技術的讀長序列短、需要模板擴增步驟等缺點，以單分子測序和讀長序列長為特點，目前已開始有一些應用。第四代測序技術以納米孔測序為代表，采用物理方法直接讀出其堿基序列，目前此技術尚處于實驗階段，無實際應用。在白酒釀造微生態研究中，應用最多是第二代測序技術中的焦磷酸測序，例如Zhang 等[57]利用焦磷酸測序分析清香型大曲的細菌群落，Tao 等[58]利用焦磷酸測序技術研究了不同窖齡窖泥的原核微生物群落結構，并研究了窖泥中微生物的群落和多樣性，Li 等[59]用焦磷酸測序方法對細菌16S rRNA 和真菌內部轉錄間隔區進行了測序，研究大曲的微生物多樣性。

隨著測序技術不斷的發展，測序數據通量呈指數級增長，生物信息學變得越來越重要，高通量測序數據的處理算法和生物信息學數據庫成為宏基因組學發展的重要基礎，目前也是宏基因組學發展的一個技術瓶頸[60]。生物信息學是隨著各種生物信息學軟件的開發而快速發展，這些軟件的功能主要有基礎分析（Cluster W、BioEdit 等）、親緣關系分析（Mage、PAUP 等）、指紋圖譜分析（Quantity One、T-Ali 等）、群落結構分析（UniFrac、Fast-UnFrac 等）、多樣性指數分析（DOTUR 等）、序列提交（Sequin、Sequence Read Archive 等）[61-63]；目前高通量測序發展較快，高通量數據/綜合分析軟件主要有Mothur、Qiime、RDP、Pipeline 等；基因序列分析的核酸序列數據庫主要有GenBank 數據庫（美國國家生物技術信息中心），EMBL 數據庫（歐洲生物信息學研究所）和DDBJ 數據庫（日本國立遺傳學研究所）[64]。這些軟件和數據庫是研究微生物生態的重要基礎，在海洋、土壤、人體、食品等領域應用廣泛。

蛋白質組學和代謝組學在對微生物生態的研究中也有應用。蛋白質組學的一種新技術——宏蛋白質組學[65]：在特定的時間對微生物群落所有的蛋白質進行分析研究的技術，在極端環境微生物的功能基因表達、特殊功能蛋白質開發以及生態元素循環等方面有一些應用。在白酒微生態研究中應用較少，但已有人利用此技術對窖泥微生態進行研究，例如Zheng 等[66]首先從30 年和300 年的窖泥微生物中提取總蛋白質和DNA，然后利用基于iTRAQ 蛋白組學技術研究微生物表達形成香味的功能蛋白質。

現在代謝組學在生態學領域也開始有越來越多的應用，主要應用在土壤、海洋等傳統生態學領域，與蛋白質組學、轉錄組學和基因組學等技術的結合應用也日益密切。代謝組學[67-68]是通過考察生物體系受到刺激或擾動前后代謝產物圖譜及其動態變化來研究生物體系的代謝網絡的一種技術，主要研究相對分子質量1000 以下的內源性小分子。近年來代謝組學與生態學相結合出現了一門新興學科——生態代謝組學[69]，其定義為對某一生物系統中產生的或已存在的代謝物組的研究的建立與發展。

各學科技術的交叉結合使用為生態學研究提供了有力的工具，我們可以利用宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學及代謝組學對釀酒微生物生態在不同層面進行研究，包括窖泥、糟醅、大曲的微生物群落結構、多樣性、以及微生物繁殖代謝與環境因子的關系、特殊功能性微生物及其產物、篩選分析未知微生物等。白酒釀造中微生物非常復雜，將來利用這些技術進一步揭示白酒微生物釀造規律，進而指導白酒生產，既可以促進生產更多優質白酒，又可以弘揚中國傳統文化。