乳及乳制品中β-內酰胺酶檢測方法研究

郝苗苗

（1.錫林郭勒職業學院，內蒙古錫林浩特 026000；2.錫林郭勒食品檢驗檢測和風險評估中心，內蒙古錫林浩特 026000）

隨著生活水平的提高，人們對于乳及乳制品食用安全問題的關注不斷增加，其中最為突出的就是乳及乳制品生產過程中的抗生素殘留問題（買合木提·克衣木等，2009）。為了防治牛乳房炎和細菌性感染疾病等，在飼養過程中普遍會對奶牛使用廣譜性β-內酰胺類抗生素藥物 （殷曉燕等，2007；崔生輝等，2007），藥物會隨著生物體代謝進入乳腺分泌的乳中，這就會導致乳中高濃度抗生素殘留。2001年9月，我國農業部頒布了《無公害食品生鮮牛乳》行業標準，規定生鮮乳中“不得檢出”抗生素（周家華等，2001）。一些不法分子為了謀求經濟利益，通過人為添加β-內酰胺酶以分解乳中抗生素藥物，使“高抗奶””變為“無抗奶”（國家藥典委員會，2015）。但β-內酰胺酶進入人體后極易引起過敏反應（彭司勛，1986）、腸道菌群失調以及耐藥性等一系列不良影響 （謝磊等，2015）。衛生部于2009年3月發布了《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治近期工作重點及要求》和《全國打擊違法添加非食用物質和濫用食品添加劑專項整治抽檢工作指導原則和方案》的通知，明確指出β-內酰胺酶是非食品用物質且屬違法添加劑。乳及乳制品中β-內酰胺酶的檢測勢在必行，然而目前國內僅在《SN/T 3979-2014乳及乳制品中β-內酰胺酶的測定方法》中規定了β-內酰胺酶的檢測方法，尚無國家檢測標準。本文通過分析當前微生物法、碘量法和高效液相色譜法等β-內酰胺酶的檢測方法，比較各方法特點和適用性，為β-內酰胺酶檢測方法的選擇提供參考，并對未來乳及乳制品中β-內酰胺酶檢測的研究進行了展望。

1 β-內酰胺酶的檢測方法

1.1 微生物法 微生物法主要有三維試驗法 （王寅等，2009）、紙片法（Awad 等，2013）、顯色培養法（周愛春，2009）以及杯蝶法（中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，2015）等。其中杯碟法是應用比較廣泛的商檢標準方法，該法采用對青霉素類藥物絕對敏感的藤黃微球菌作為標準菌株，在樣品中加入青霉素G作為對照，利用舒巴坦的特異性抑制β-內酰胺酶的活性，通過比對加入舒巴坦與未加入舒巴坦的樣品所產生抑菌圈的大小，來間接測定樣品中是否含有β-內酰胺酶類藥物。

歐陽雪君等（2014）用杯蝶法檢測牛乳中β-內酰胺酶，檢測結果良好，檢出限為0.2 U/L。郭長紅等 （2018）依據微生物杯蝶法對吉林市生乳中β-內酰胺酶進行調查檢測。侯東軍等（2013）研究了原料乳的保藏溫度、保藏時間等因素對微生物杯蝶法檢測結果的影響，并通過相應的優化試驗，提高了微生物法檢測的準確性。

微生物法因檢測費用較低、抗生素靈敏度好，而在實驗室被廣泛應用，但該法檢測過程繁瑣、影響因素較多、檢測時間較長，不適用于條件較低的奶站牧場，并且只能對β-內酰胺酶進行定性檢測，并不能對抗生素的種類和含量進行定性、定量分析。

1.2 碘量法 碘量法主要是β-內酰胺酶與青霉素作用產生的青霉噻唑酸會競爭溶液中的碘離子，從而使淀粉褪色，通過顏色的變化來判斷其是否含有β-內酰胺酶。

歐陽雪君等（2014）在無抗牛乳中按梯度添加β-內酰胺酶，以純水為空白對照，加入淀粉溶液和碘液，并及時混勻后在2 min內觀察樣液顏色，依據變色情況進行定量檢測，檢出限為4.0 U/L。Chao等（2013）以碘量法為依據制作凝膠試劑盒，其可對不同類型的底物以及酶活性進行直接測定，檢測時間0.5 h，檢出限為0.1 U/mL。蒙嘉鵬（2016）在進行碘量法測定時發現，若樣品未進行去脂肪處理，其實驗重現性低，褪色反應快，極易出現假陽性。

碘量法檢測時間短、成本低且操作簡單，適用于現場采樣檢測，多為奶站、樣品收購等實驗室進行初篩使用，但該方法對反應時間、溫度等條件要求較嚴格，每次試驗均需要設置陽性和陰性對照，同時要避免乳及乳制品中的油脂造成的靈敏度低和重現性差等情況。

1.3 酸度計法 酸度計法檢測原理是青霉素在β-內酰胺酶的作用下被水解生成青霉噻唑酸，該酸又可電離產生H+，使樣品的pH下降，根據穩態處理米氏方程：v＝K[E][S]/（K m+[S]）（崔生輝等，2007），利用酸度的變化測定β-內酰胺酶的殘留量。

馬潔等（2009）利用雙酸度計檢測，通過方法優化以抵消干擾因素的影響，最低檢出限達到15 U/mL，同時得到米氏常數為0.0351 mmol/L。劉珊珊等（2010）利用此原理改進牛奶中β-內酰胺酶的檢測，以牛奶為基本反應體系，嚴格控制溫度、聲波、震動等外界環境干擾，繪制標準曲線進行檢測，其最低檢出限為8.29 U/mL。張鑫瀟（2011）利用酸度法測定市售純牛奶中β-內酰胺酶含量，當β-內酰胺酶的濃度一定時，酶催化青霉素底物反應速率增快，pH變化量隨之增加，而當青霉素的濃度達到25 mg/mL時，反應速率達到頂峰后pH變化量基本保持不變。該方法相關性好，理論最低檢出限為12.3 U/mL。

早在1961年Saz等就建立了用于致病性金黃色葡萄球菌胞外酶測定的酸度法，后來衍生出許多酸度指示劑方法，甚至用一些酸度定量紙片來檢測β-內酰胺酶。該法雖簡單易行、易獲取結果，但假陽性和假陰性問題較嚴重。

1.4 高效液相色譜法 高效液相色譜法主要有間接測定法和直接測定法兩種，其中間接測定法是指向樣品中定量添加青霉素，根據青霉素經β-內酰胺酶酶解后濃度降低量，從而檢測樣品中是否存在β-內酰胺酶；直接測定法則是將樣品中的青霉素鉀經β-內酰胺酶酶解后生成青霉噻唑酸鉀，經前處理后，上機進行青霉噻唑酸鉀測定，從而檢測β-內酰胺酶含量。

李雪芳等（2015）以乳粉為基質定量添加β-內酰胺酶酶解青霉素鉀，后經高效液相色譜測定青霉素鉀含量，當β-內酰胺酶添加量為0.2～1.4 mg/L時，青霉素鉀濃度的減少量與β-內酰胺酶的濃度呈較好的線性關系，相關系數為0.99，回收率為89.0%～95.0%，該方法檢測靈敏度高、回收率和重現性良好。林楠（2008）利用高效液相色譜法直接測定青霉噻唑酸鉀含量，檢測限為20μg/L，回收率為76.4%～81.3%。

現有的液相色譜方法靈敏度和準確度較好，但檢出限略高，樣品前處理過程繁瑣，所用儀器對實驗人員要求較高，檢測成本昂貴。

1.5 快速高分離液相色譜-串聯質譜法（RRLCMS/MS） 快速高分離液相色譜-串聯質譜法與高效液相色譜法原理相同，利用β-內酰胺酶能夠酶解青霉素族藥物的特性，在樣品中加入適量氨芐青霉素進行酶解，并檢測原樣品中氨芐青霉素酶解率，完成對β-內酰胺酶定性、定量的檢測。孫漢文等（2010）將原乳中氨芐青霉素經乙腈提取、凈化和濃縮后，利用RRLC-MS/MS多反應監測模式進行定性與定量分析，結果表明，該方法檢出限為4 U/mL，回收率為92.3% ～95.5%。

RRLC-MS/MS法雖然具有靈敏度高，檢測時間相對短的優點，但由于儀器設備昂貴，對操作人員要求較高而無法普遍開展。

1.6 試劑盒檢測法 王艷華等（2014）依據β-內酰胺酶在原料乳中可降解青霉素G的原理，利用SNAPβ-內酰胺類抗生素檢測試劑盒進行β-內酰胺酶檢測，并通過多次試驗確保了該方法的重復性和抗干擾性能，該方法的檢出限為4 IU/mL。謝巖黎等（2014）依據β-內酰胺酶能將青霉素鉀分解形成青霉噻唑酸，其可將Cu2+還原為Cu+，并與2，2′-聯喹啉反應后生成紫紅色絡合物，利用可見分光光度計進行檢測，該絡合物顏色變化與β-內酰胺酶的含量在一定范圍內呈線性關系，方法最低檢出限為4 U/mL。此外，張威等（2018）使用Charm試劑盒進行牛奶中β-內酰胺酶含量測定，結果表明，檢測限為4 U/mL，該方法雖與杯碟法得出的結果無明顯差別，但仍存在檢出假陽性的情況。

試劑盒檢測方法速度快，成本低，但因其尚未列入到國家標準中，目前僅限于前期快速檢測或樣品初步驗收，可選用其進行大量樣品篩查，若出現陽性樣品則應采用杯碟法進一步試驗以確證。

1.7 其他檢測方法 沈祝飛等（2015）以美羅培南作反應底物，用中性羥胺與硫酸鐵胺進行顏色反應，通過紫外分光光度計檢測美羅培南剩余含量，間接測定金屬β-內酰胺酶含量，該方法檢測限為0.05 U，回收率為90%～119%。顯色頭孢菌素法檢測β-內酰胺酶與酸度計法原理相似，β-內酰胺酶與顯色頭孢菌素發生特異性的顏色反應從而進行定量檢測，但頭孢硝噻吩不僅價格昂貴，而且易與蛋白質結合，從而導致檢測結果出現假陽性（唐群力，2008）。除以上方法外，β-內酰胺酶的檢測方法還有酶熱生物傳感器法 （周爽等，2013）、SDS-PAGE 電泳法（張鑫瀟，2011）、酶聯免疫法（姜侃等，2013）等。

2 目前存在問題與展望

通過對傳統方法的分析以及對現有檢測技術的討論，β-內酰胺酶在檢驗檢測方法和技術標準上仍存在諸多問題。

2.1 β-內酰胺酶標準品狀態與單位不統一 在檢測過程以及文獻查閱過程中發現，不同廠家生產的β-內酰胺酶標準品，其酶活性單位以及藥品狀態不一。其中Sigma公司為13 U/mg（干粉），TCI為 250萬 U/瓶（干粉）或 12萬 U/mL（液態），中國食品藥品鑒定研究院為600萬U/2 mL（液態），北京康牧興農發展中心為300萬IU/mL（液態）。標準品的狀態與單位均會對β-內酰胺酶檢測結果的可比性產生影響。酶的貯存狀態會直接影響酶的活力，液態酶標品開封后酶活性降低較快，不易保存，而干粉狀標準品易于保存，溶解后在較長時間內活性相對穩定。并且U（單位）和IU（國際單位）（這里的單位是指生物效價單位）之間是沒有互相換算的關系（湖北畜牧獸醫，2008）。在今后的檢測過程中應統一酶活力單位，以確定不同的β-內酰胺酶活性換算關系以及酶在最適條件下的單位活性之間的差異。

2.2 無法區分內、外源性β-內酰胺酶 目前已知的各種檢測方法仍無法進行內、外源性區分，這可能會導致檢測中假陽性的出現。外源性β-內酰胺酶多為人為添加，內源性β-內酰胺酶大多由牛體本身產生或牛感染了某些具有抗性的微生物，這些微生物在體內能夠分泌β-內酰胺酶，從而導致樣品檢測呈陽性（姜侃等，2013）。為進一步優化完善β-內酰胺酶檢測方法，應建立內、外源性β-內酰胺酶分離檢測技術，并對內、外源性β-內酰胺酶產生機理進行研究。

2.3 微生物法中標準菌株的選擇 在實驗過程中購買的商業化藤黃微球菌按微生物標準方法活化后，進行菌落計數結果發現，其活菌不能達到實驗要求的1×108～1×109cfu/mL。需對菌體進行富集后，再調節菌體濃度使之滿足標準要求。此外，藤黃微球菌在上機（微生物全自動分析儀）鑒定驗收時會出現無法鑒定出結果的情況，有些菌種鑒定儀器已將藤黃微球菌重新分類為嗜根庫克菌（Kocuria rhizophila）（Jane 等，2003）， 所以在菌種購買與選擇上應盡量購買CICC或ATCC菌株。

2.4 試劑與儀器檢測前處理除脂 不論是碘量法、酸度計法以及液相色譜法在實驗過程中都應去除油脂，以避免油脂導致顏色反應，影響上機檢測結果。可考慮采用物理方法超高速離心機進行高速離心，此法對離心機要求轉速為21000 r/min（李雪芳等，2015），或者采用化學試劑正己烷、石油醚等進行中和。

3 小結

目前β-內酰胺酶檢測方法較多，如微生物法、碘量法、酸度計法以及其他方法等。但沒有一種快速、準確、高效的檢測方法，能為仲裁檢測提供依據。因此，優化現有方法或重新建立一種可方便快捷檢測β-內酰胺酶，又可區分內、外源性β-內酰胺酶的檢測方法具有重要意義。β-內酰胺酶檢測作為乳及乳制品安全性評價中的一種指標，一個輔助手段，仍需從源頭進行風險管控，建議加強畜牧業與乳及乳制品生產全過程的監控。