HPV mRNA、DNA檢測對宮頸細胞學ASCUS分流診斷價值的Meta分析

陸璐，余慧萍，成建

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一。宮頸脫落細胞的細胞學檢查在宮頸癌篩查中至關重要，是目前國內外宮頸癌篩查指南中不可或缺的方法。未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）是伯塞斯達系統（TBS）分類法中最常見的細胞學病變描述，其細胞改變程度較反應性改變細胞明顯，且有進展為宮頸上皮內瘤變（CIN）Ⅱ級或Ⅲ級等高度鱗狀上皮內病變的可能［1］,故對ASCUS 患者進行及時有效地評價和分流管理，有利于患者的診治和預后。

2016 年美國婦產科醫師學會推薦的宮頸癌篩查及預防指南建議將高危型人乳頭瘤病毒（HPV）DNA檢測結果作為ASCUS人群主要的分流依據，即HPV DNA 陽性者行陰道鏡檢查［2］。但是，由于HPV感染具有一過性的特點，單純HPV DNA檢測可能出現假陽性結果，造成長期過密的隨訪和不必要的陰道鏡檢查。HPV E6/E7 mRNA檢測是近年來興起的一種新型檢測技術，可以檢測高危型HPV E6/E7 癌基因的mRNA表達情況。該檢測方法能較好地反映癌基因的活動度，更好地預測宮頸病變的風險［3］，因此逐漸應用于臨床宮頸癌篩查。目前已有較多研究對HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測技術在宮頸癌篩查中的診斷準確性進行對比分析，但針對兩者在ASCUS人群分流中應用價值的比較研究尚少見。本研究對關于HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測對ASCUS人群分流價值的診斷研究進行Meta分析，以期為臨床優化ASCUS 患者的分流處理提供循證醫學證據。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準 納入標準：（1）國內外公開發表的關于HPV E6/E7 mRNA與HPV DNA檢測對ASCUS人群分流價值的診斷研究。（2）研究中有宮頸HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測的結果。（3）以病理組織學診斷為金標準。（4）有完整的原始數據，能直接或間接獲得篩查試驗的真陽性值（TP）、假陽性值（FP）、假陰性值（FN）、真陰性值（TN）。排除標準：（1）樣本量≤60例。（2）無病理結果。（3）數據不完整、不能獲得完整資料的文獻。（4）綜述、重復報道、會議內容等。

1.2 文獻檢索策略 采用主題詞和自由詞相結合的方式，分別以宮頸、人乳頭瘤病毒、未明確診斷意義的非典型鱗狀上皮 細 胞、HPV、mRNA 為 中 文 檢 索詞，以cervical、human papillomavirus、HPV、mRNA、E6/E7、ASCUS為英文檢索詞，檢索MEDLINE、EMbase、Cochrane Library、Web of Science、萬方數據庫、維普數據庫和中國知網（CNKI）等數據庫，并采用文獻追溯等方法搜集關于HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測對ASCUS 人群分流診斷價值的研究。語言限制為中、英文。檢索時限為2010年1月1日—2019年12月31日。

1.3 文獻篩選及數據提取 由2 位研究者分別獨立根據納入與排除標準篩選文獻。首先，閱讀文題和摘要，剔除重復、不符合納入與排除標準的文獻，對于部分重復發表或數據有重疊現象的文獻，選取樣本量最大、最近發表或信息最詳細者；其次，對可能納入的文獻進一步閱讀全文并交叉核對結果；最后，對存在異議的文獻，則研究小組討論決定是否納入。對納入文獻提取以下數據資料：（1）研究的基本信息，包括第一作者、發表時間、國家等。（2）研究對象的基本特征，包括樣本量、年齡等；HPV mRNA和HPV DNA檢測選用試劑盒的檢測原理，如HPV mRNA 檢測選用PreTect HPV-Proofer、APTIMATM等試劑盒檢測原理；HPV DNA 檢測選用第二代雜交捕獲法（Hybrid Capture 2，HCⅡ）或PCR 反向雜交等原理。（3）偏倚風險評價的關鍵要素，包括病例選擇（Patient Selection）、待評價試驗（Index Test）、金標準（Reference Standard）及病例流程和進展情況（Flow and Timing）4個部分。（4）實驗原始數據，直接獲取或計算得出TP、FP、FN、TN。

1.4 納入研究的偏倚風險評價 采用RevMan 5.3 軟件中的診斷性試驗準確性質量評價工具-2（QUADAS-2）對納入研究進行偏倚風險評價。由2名評價者根據標準獨立評價，如遇分歧，則研究小組討論協商。

1.5 統計學方法 采用Meta-Disc 1.4軟件檢測異質性，包括閾值效應和非閾值效應引起的異質性及異質性來源。采用敏感度對數與（1-特異度）對數的Spearman 相關系數檢驗是否存在閾值效應，P≥0.05表示不存在閾值效應。以診斷比值比（DOR）為效應量，對不同檢測方法的DOR 進行Cochrane-Q 檢驗，檢測水準α=0.1，同時結合I2判斷異質性大小。當P＞0.1和I2≤50%，無異質性，采用固定效應模型進行Meta 分析；當P≤0.1或I2＞50%，存在異質性，則進一步分析異質性來源，采用隨機效應模型進行Meta 分析。計算HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測合并的敏感度（SEN）、特異度（SPE）、陽性似然比（PLR）、陰性似然比（NLR）及其95%CI。采用線性模型擬合受試者工作特征（SROC）曲線，計算曲線下面積（AUC），AUC 越接近1，認為診斷價值越高。采用Stata 12.1軟件，以Egger線性回歸法對納入文獻進行偏倚檢測，采用標準正態離差（standard normal deviate，SND）對效應估計值的精確度（precision）作回歸分析。SND 的定義為OR與其標準誤（SE）的比值，精確度的定義為SE的倒數。P＞0.05提示不存在發表偏倚。

2 結果

2.1 文獻篩選流程及結果 初檢出相關文獻1 536篇。經剔除重復文獻，閱讀摘要及全文后，按照納入、排除標準進一步篩選，最終納入文獻15篇，包括ASCUS患者4 019例。文獻篩選流程及結果見圖1。納入研究的基本特征見表1。

Fig.1 Flow diagram of screening articles圖1 文獻篩選流程圖

2.2 所納入的研究偏倚風險評價結果 15 項研究均說明了納入研究對象的條件，其中5 項未能避免不恰當的排除；15項研究均對研究對象進行宮頸活檢，7項研究采用了盲法，具有可靠的金標準；6項研究描述了初步篩查與陰道鏡活檢的時間間隔。各研究的偏倚風險評價結果見圖2。

2.3 異質性分析結果 HPV E6/E7 mRNA 與HPV DNA 檢測的Spearman 相關系數rs分別為0.222（P=0.427）和0.466（P=0.080），提示不存在閾值效應。Q檢驗顯示，研究人群中HPV mRNA檢測的Cochrane-Q 為23.610，P=0.051，I2=40.7%；HPV DNA 檢測的Cochrane-Q 為28.570，P=0.012，I2=51.0%，提示各研究結果間存在統計學異質性。

Fig.2 Risk assessment of bias in included studies圖2 納入研究的偏倚風險評價

Tab.1 The basic characteristics of included studies表1 納入文獻的的基本研究特征

2.4 亞組分析與Meta 回歸分析結果 將HPV E6/E7 mRNA 檢測和HPV DNA 檢測分別按樣本量、檢測原理進行亞組分析。結果顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測研究間的異質性可能與檢測原理有關，HPV E6/E7 mRNA 檢測和HPV DNA 檢測研究間的異質性可能與樣本量有關，見表2。Meta 回歸分析結果顯示，2種檢測方法異質性來源與以上2種變量無明顯相關性（均P＞0.05），見表3。

2.5 Meta 分析結果 異質性分析結果顯示，HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 各研究結果間存在統計學異質性（I2分別為40.7%、51.0%，均P≤0.01），經異質性分析處理后，仍無法消除，故選擇隨機效應模型合并統計量。HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA 在ASCUS人群檢出CINⅡ+合并的SEN、SPE、PLR、NLR 及其95%CI見表4，其診斷比值比的Meta 分析結果見圖3、4。建立匯總受試者SROC 曲線，2 種檢測方法檢出CINⅡ+的AUC 分別為0.847 和0.760，見圖5、6。結果顯示，除SEN 外，HPV E6/E7 mRNA 檢測在ASCUS 人群檢出CINⅡ+的宮頸病變的診斷效能優于HPV DNA檢測。

2.6 發表偏倚評估 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA各研究均不存在明顯的發表偏倚（P分別為0.134和0.163），見圖7。

Tab.2 Subgroup analysis results of included studies表2 納入研究異質性的亞組分析結果

Tab.3 Meta regression analysis results of two detection methods表3 2種檢測方法的Meta回歸分析結果

Tab.4 Combined results of the two test methods表4 2種檢測方法的合并診斷效能

3 討論

美國癌癥學會（ACS）發布的“全球癌癥統計2018”顯示，在全球185 個國家的860 萬例女性癌癥新發病例及420 萬癌癥死亡病例中，宮頸癌的發病率（6.6%）、死亡率（7.5%）均排名第4 位［19］。2019 年中國國家癌癥中心發布的全國癌癥統計數據顯示，2015 年我國宮頸癌發病率位居女性惡性腫瘤第6位，死亡率位居女性惡性腫瘤第8 位。普及防癌知識，開展宮頸癌篩查，做到早發現、早診斷、早治療可以有效降低宮頸癌的發病率、死亡率，尤其是在經濟衛生條件相對落后的農村地區。宮頸脫落細胞的細胞學檢測是目前宮頸癌篩查策略的基礎，按照現有的篩查策略，臨床醫師會建議細胞病理診斷為ASCUS的患者進一步接受HPV檢測。

目前研究一致認為，宮頸癌的發生、發展與高危型HPV 的感染有關［20］。但女性一生中感染HPV 的概率高達80%，其中絕大部分感染是一過性的，2～3年可被自身免疫清除，超過91%的ASCUS及低度鱗狀上皮內病變（LSIL）患者HPV 感染在6～24 個月自動清除［21］。在宮頸上皮細胞癌變過程中，HPV 需將其E6/E7 DNA 整合入宮頸上皮細胞基因組中，轉錄生成E6/E7癌蛋白，兩者分別與抑癌蛋白p53和pRb結合，干擾細胞周期調節，導致細胞無限分裂最終引起癌變［22］。E6/E7 mRNA 正是病毒癌基因的轉錄產物，其在宮頸上皮細胞的過度表達是導致宮頸癌的關鍵因素［23］。

Fig.3 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV E6/E7 mRNA test圖3 HPV E6/E7 mRNA檢測診斷比值比的Meta分析

Fig.4 Meta analysis of diagnostic ratio of HPV DNA test圖4 HPV DNA檢測診斷比值比的Meta分析

Fig.5 SROC curve of HPV E6/E7 mRNA diagnosis for CINⅡ+in research objects圖5 研究對象中HPV E6/E7 mRNA檢測診斷CINⅡ+的SROC曲線

Fig.6 SROC curve of HPV DNA diagnosis for CINⅡ+in research objects圖6 研究對象中HPV DNA檢測診斷CINⅡ+的SROC曲線

Fig.7 Funnel plots for assessment in published literature圖7 發表偏倚評估漏斗圖

近年來，文獻報道了HPV E6/E7 mRNA 檢測在ASCUS人群中的分流診斷價值，但與HPV DNA檢測相比，其診斷效能仍存爭議。本研究共納入15項研究，共計4 019 例患者，系統比較2 種檢測方法對ASCUS 人群的分流診斷價值。Meta 分析結果顯示，與HPV DNA 檢測相比，HPV E6/E7 mRNA 檢測的合并敏感度低、特異度高，提示其在ASCUS 人群中檢出CINⅡ+的價值優于HPV DNA檢測，這與國外一篇薈萃分析［24］結論一致，分析其原因可能與2 種檢測方法的檢測原理有關。HPV DNA 檢測是對宿主細胞內游離狀態與整合狀態的HPV DNA進行檢測，無法判斷HPV感染階段和病毒癌基因的活性情況；而HPV mRNA檢測僅檢測整合狀態的病毒RNA片段，大大降低了假陽性出現的概率。同時，根據SROC曲線，2種檢測方法的AUC 分別為0.847和0.760，提示HPV E6/E7 mRNA 檢測的診斷效能優于HPV DNA檢測，有望成為ASCUS患者分流的一種更為有效的檢測方法。此外，HPV E6/E7 mRNA 檢測的陽性似然比高于HPV DNA 檢測，分別為2.40 和1.59，提示E6/E7 mRNA 陽性的ASCUS 患者較HPV DNA陽性者更易出現CINⅡ+病變。因此，對于HPV E6/E7 mRNA 陽性的ASCUS 患者，應引起警惕，并采取更積極的治療方案，從而改善患者的臨床結局；但HPV E6/E7 mRNA檢測敏感度低可能會引起一定的漏診，并且國內外對其定量檢測的最佳診斷臨界點尚存爭議［25］。因此，在細胞學檢查的基礎上，開展HPV E6/E7 mRNA 檢測對ASCUS 人群進行分流，尚需高質量、大樣本的臨床數據支持。臨床上應對各項HPV 檢測技術進行客觀、科學的評價，并結合中國醫療現狀，制定出適應我國國情的宮頸癌篩查策略。

在異質性分析時，亞組分析結果顯示，HPV E6/E7 mRNA 檢測研究間的異質性可能與檢測原理的差異有關；而HPV DNA檢測研究間的異質性可能與研究樣本量有關。通常小樣本研究可能會呈現更好的診斷準確性，納入研究的檢測原理不同、選擇試劑盒的差異甚至檢測儀器的不同，均會引起測量偏倚，導致異質性的出現。由于本研究進行Meta 回歸時未能找出異質性的主要來源，故影響結果的準確性。本研究尚有一定局限性：（1）納入的研究僅為中、英文文獻，其他語種文獻未能納入。（2）部分納入的研究質量不高，未提及是否使用盲法。（3）納入的研究檢測原理不盡相同，雖進行了亞組分析，但異質性仍無法消除，可能與研究設計不同、研究對象的種族年齡存在差異有關。

綜上所述，對于ASCUS患者，HPV E6/E7 mRNA和HPV DNA檢測在診斷CINⅡ+的宮頸病變中，均具有一定的診斷價值，HPV E6/E7 mRNA 檢測的診斷效能優于HPV DNA 檢測，尤其是其檢測特異度較高。由于納入研究的對象和質量有限，上述結論仍有待進一步研究驗證。