響應面法優化苦蕎麥水溶性清蛋白提取工藝研究

吳穎，王嘯，邱樹毅，馬琳娜，張芮瑞，蒲璐璐

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州貴陽550025）

苦蕎麥，又名萬年蕎、野蘭蕎，簡稱苦蕎，學名“韃靼蕎麥”（Fagopyrum tararicum），屬蓼料雙子葉植物[1]，起源于中國西南地區[2]，在陜西、山西、甘肅、云南、貴州、四川等省份均有栽種，是一種藥食同源的農作物。苦蕎麥含有淀粉（40.70%～86.41%）[3]、蛋白質（8.51%～18.87%）[4]、膳食纖維（3.4%～5.2%）[5]、微量元素以及抗氧化劑[6]等營養物質，與一般的糧食作物相比有較好的營養價值。苦蕎麥富含的18種氨基酸中[7]，賴氨酸、甘氨酸和精氨酸含量相對較高，可以成為其它食品的補充劑[8]。苦蕎麥蛋白有降低膽固醇、抗高血壓、改善便秘和肥胖[9-11]、抗疲勞、抑菌等生理活性[12-13]。苦蕎麥蛋白與豆類作物相似，根據能在不同的溶劑中溶解可分為清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白。不同地區苦蕎麥各蛋白組分有所差異，苦蕎麥不同部位蛋白所占比例也有差異。大部分研究顯示清蛋白和球蛋白含量相對較高[3]，而其余兩種蛋白含量則相對較少[8，14]，李紅梅等[15]在研究貴州威寧苦蕎麥蛋白時得出清蛋白占總蛋白42.65%；有關學者[16]在研究甘肅定西苦蕎麥蛋白時得出清蛋白占總蛋白32.20%。苦蕎麥中不同蛋白均具有不同程度的降血脂功能，其中降血脂能力依次為清蛋白>球蛋白>谷蛋白[17]。李相沂[18]通過研究苦蕎麥不同蛋白組分，分析表明在中性蛋白酶作用下清蛋白的酶解物對血管緊張轉化素酶（angiotensin converting enzyme，ACE）有抑制活性，其抑制率可達33.38%，除此之外清蛋白還有較好的功能特性。目前對清蛋白提取條件進行優化的研究多集中在綠豆、蕓豆、菜籽粕、米糠等谷物和副產物[19]。苦蕎麥蛋白的研究大部分集中在對總蛋白的提取條件進行優化，而對苦蕎麥清蛋白提取條件的優化相對較少。

目前對苦蕎麥蛋白提取的方法主要有堿法提取、酶法提取、微波輔助提取、等電點法、Osborne分級法。大部分研究者多采用傳統的堿溶酸沉法，但是在使用酸堿的過程中，容易引起蛋白質中部分氨基酸發生反應從而生成有毒物質，而且大量使用酸堿也會對環境造成污染。Osborne分級法提取蛋白操作簡單、成本低。本文采用響應面法多個影響因素與響應值之間的函數關系，利用Box-Behnken中心組合試驗設計，對試驗數據進行分析，利用二次回歸方程進行擬合，通過數據分析找出最佳工藝條件，為苦蕎麥水溶性清蛋白的提取及綜合開發利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 原料和試劑

苦蕎麥：采摘于貴州省威寧縣；85%磷酸：成都金山化學試劑有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250：北京索萊寶科技有限公司；95%乙醇、石油醚：天津市富宇精細化工有限公司。

1.1.2 主要儀器

冷凍型多功能離心機（Thermo CR3i）：美國賽默飛世爾科技公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：上海邦西儀器科技有限公司；酶標儀（Spectra-Max190）：MolecularDevices；電子分析天平（FA2004N）：上海菁海儀器有限公司；高速多功能粉碎機（XTP-200G）：浙江永康市紅太陽機電有限公司；循環水式多用真空泵（SHB-Ⅲ）：鄭州長城科工貿有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料的處理

將干燥的苦蕎麥種子于多功能粉碎機中粉碎，過80目篩。在苦蕎麥粉中以1∶5（g/mL）的比例加入石油醚進行脫脂處理，脫脂期間數次更換石油醚[20-22]將脫脂后的苦蕎麥粉過濾收集，于通風櫥中風干備用[23]。

1.2.2 苦蕎麥粗蛋白質含量測定

苦蕎麥粗蛋白質含量測定采用凱氏定氮法，參照GB 5009.5-2016《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》[24]。

1.2.3 蛋白提取率計算方法

蛋白質提取率/%=提取液中蛋白質質量/苦蕎麥粉中粗蛋白質質量×100[25]

1.2.4 蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法G-250測定蛋白含量：以牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為標準品，分別吸取濃度為0.10 g/mL的標準蛋白溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL于試管中，用雙蒸水補足溶液為1.00 mL。每管加入5.00 mL考馬斯亮藍G-250溶液反應5 min后，在595 nm條件下使用酶標儀測定蛋白吸光度，繪制牛血清白蛋白標準曲線[26]。建立回歸方程：y=0.003 9x+0.006 2（R2=0.9973），其中 y 為吸光度，x為蛋白質質量濃度（mg/L），蛋白質標準曲線見圖1。

圖1 蛋白質標準曲線Fig.1 Protein standard curve

1.2.5 苦蕎麥清蛋白提取工藝

稱取5.00 g處理過的苦蕎麥粉，按一定的料液比將苦蕎麥粉置于雙蒸水中攪拌提取，在一定溫度和攪拌速度下，攪拌浸提一定時間后，在8 000 r/min的轉速下離心20 min，取上層清液測定蛋白含量。

1.2.6 苦蕎麥清蛋白提取單因素試驗

1.2.6.1 料液比對苦蕎麥水溶性清蛋白提取率的單因素試驗

取5.00 g苦蕎麥粉，在攪拌45 min，35℃的條件下做料液比 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）的單因素試驗，在轉速為8 000 r/min，20 min的條件下離心取上清液測定蛋白含量。

1.2.6.2 時間對苦蕎麥水溶性清蛋白提取率的單因素試驗

取5.00 g苦蕎麥粉，在料液比為1∶10（g/mL），35℃的條件下做攪拌時間為 30、45、60、75、90 min 的單因素試驗，在轉速為8 000 r/min，20 min的條件下離心取上清液測定蛋白含量。

1.2.6.3 溫度對苦蕎麥水溶性清蛋白提取率的單因素試驗

取 5.00 g苦蕎麥粉，在料液比為 1 ∶10（g/mL），攪拌浸提時間為45 min的條件下做溫度為30、35、40、45、50℃的單因素試驗，在轉速為8 000 r/min，20 min的條件下離心取上清液測定蛋白含量。

1.2.7 提取苦蕎麥清蛋白響應面試驗

本試驗選取料液比、攪拌時間、攪拌溫度3個影響因素，以清蛋白提取率為響應值，優化提取清蛋白的最佳工藝參數。根據設計結果共17個組合試驗，其中12個組合為分析試驗，5個組合為中心試驗[27]。設計三因素三水平的響應分析試驗，每個試驗組合重復測定2次，取其平均值作為結果，其因素水平編碼表見表1。

表1 Box－Behnken試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of Box－Behnken design

1.3 數據處理

采用 Origin 9.0軟件進行作圖和 Design-Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken設計及數據分析和方差分析。

2 結果與討論

2.1 料液比對苦蕎麥清蛋白提取率的影響

料液比對苦蕎清蛋白提取率的影響見圖2。

圖2 料液比對苦蕎清蛋白提取率的影響Fig.2 The influence of solid－liquid ratio on the buckwheat albumin extraction yield

由圖2可知在料液比為1∶5（g/mL）時，蛋白提取率最低，可能是溶劑太少且苦蕎麥中含有較多的淀粉，溶劑可能被淀粉吸收，提取黏度大，沒有足夠的溶劑去溶解清蛋白，導致清蛋白溶出困難[28]。隨著溶劑體積的增加，蛋白提取率與料液比呈正相關，當料液比為1∶20（g/mL）時，蛋白提取率達到最大值31.06%，溶劑體積的增加有助于清蛋白的溶出。隨后蛋白提取率開始下降，可能是蛋白的溶出已達到飽和狀態，苦蕎麥清蛋白與水結合力降低，隨著溶劑體積的增加清蛋白濃度反而減小，清蛋白提取率下降。有研究者[29]對苦蕎麥麩皮的清蛋白進行提取，得出最佳工藝參數為：料液比 1∶12（g/mL），提取溫度 35℃，提取時間60 min。因清蛋白提取的部位不同，所以最佳料液比有所差異。

2.2 時間對苦蕎麥清蛋白提取率的影響

時間對苦蕎清蛋白提取率的影響見圖3。

圖3 時間對苦蕎清蛋白提取率的影響Fig.3 The influence of time on the buckwheat albumin extraction yield

從圖3可知當提取時間從30 min增加到60 min時，蛋白提取率與時間呈正相關，在提取時間為60 min時，清蛋白溶出達到飽和狀態，蛋白提取率達到最大22.91%。隨著提取時間的繼續增加蛋白質可能發生分解和變性，或是其它成分與蛋白質發生了結合，導致蛋白含量下降[30]。楊海霞[31]在提取內蒙甜蕎清蛋白時，提取時間為30 min時達到最佳，有研究者[18]在料液比為1∶10（g/mL），溫度為40℃，提取時間為3 h的條件下甜蕎清蛋白得率為（4.95±2.23）g/100 g，可能本試驗用的是苦蕎，因品種不同所以最佳提取時間有所差異。

2.3 溫度對苦蕎麥清蛋白提取率的影響

溫度對苦蕎清蛋白提取率的影響見圖4。

從圖4可以看出30℃～35℃之間隨著溫度增加蛋白提取率增加，可能是剛開始溫度的增加有助于分子的擴散運動，從而利于蛋白質溶出[32]，蛋白提取率上升，35℃時達到最大值。35℃以后蛋白提取率與溫度成負相關，溫度越高蛋白提取率反而下降，可能是清蛋白是熱不穩定、對溫度較敏感的蛋白質[33]，過高的溫度對維持蛋白質空間結構造成破壞，導致清蛋白溶出少，且過高的溫度會影響蛋白質的營養價值，所以清蛋白提取溫度為35℃。陳曉萌[30]在提取大紅蕓豆清蛋白時，研究發現在40℃時蛋白提取率最大，過高的溫度則引起蛋白質變性，提取率反而降低。姚海霞[19]在提取竹豆清蛋白時，45℃時清蛋白提取率達到最大，在55℃時蛋白提取率顯著下降，可能是蛋白已經發生變性。因選取的原料有差異，所以清蛋白的最佳提取溫度有所差異。

圖4 溫度對苦蕎清蛋白提取率的影響Fig.4 The influence of temperature on the buckwheat albumin extraction yield

2.4 響應面試驗設計及結果

根據提取苦蕎麥清蛋白單因素試驗結果，由Design-Expert 8.0.6軟件設計出的試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 The response surface design of experimental results

2.5 回歸方程及方差分析

通過表2的試驗數據，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行擬合，得如下回歸方程：蛋白提取率=36.12-0.74A-0.19B+0.13C-1.03AB+0.59AC+0.20BC-3.46A2-3.64B2-3.34C2。

響應面數據的方差分析結果見表3，結果顯示該模型p值小于0.000 1，表明回歸模型極顯著。失擬檢驗是一種用來判斷回歸模型是否可以接受的檢驗，本試驗失擬誤差p=0.765>0.05，表明該模型與試驗擬合誤差不顯著，數據較準確，該模型可以使用。本試驗決定系數R2=0.9822，表明有98.22%的數據可以用此方程解釋；校正系數R2adj=0.987 2，表明該試驗結果有98.72%受控制因素的影響，未控制因素對試驗結果造成的影響很小[32]。變異系數C.V.%=2.20%，C.V.%值越小，試驗越可靠，精確度越高，可對苦蕎麥清蛋白的提取工藝做初步分析和預測，試驗實際值與預測值幾乎一致。由各因素的p值可知，對苦蕎麥清蛋白提取率影響順序依次為：料液比（A）>攪拌時間（B）>攪拌溫度（C）；各因素之間交互作用對苦蕎麥清蛋白提取率影響順序依次為：料液比與時間（AB）>料液比與溫度（AC）>時間與溫度（BC）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

2.6 響應面結果分析

料液比與時間交互作用對苦蕎清蛋白提取率的影響見圖5。

圖5 料液比與時間交互作用對苦蕎清蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of material-liquid ratio interaction with time on the buckwheat albumin extraction rate

由圖5的響應面圖可知當料液比不變時，隨著時間的增加，蛋白提取率呈現先上升后下降的趨勢；當時間一定時，隨著溶劑體積的增加，蛋白提取率呈現先上升后下降的趨勢，在響應面的最頂處出現最大響應值。等高線圖呈橢圓形，顏色逐漸加深，料液比和時間（AB）交互作用顯著，在圖5的等高線圖中最小橢圓的中心點位置有響應面最大值。

料液比與溫度交互作用對苦蕎清蛋白提取率的影響見圖6。

圖6 料液比與溫度交互作用對苦蕎清蛋白提取率的影響Fig.6 Effect of interaction between feed-liquid ratio and temperature on the buckwheat albumin extraction rate

由圖6的響應面圖可知當其中一個變量不變時，蛋白提取率均呈現先上升后下降的趨勢，在響應面的最頂處出現最大響應值。在圖6的等高線圖中最小橢圓的中心點位置有響應面最大值，料液比與溫度（AC）的交互作用次于（AB）。

時間與溫度交互作用對苦蕎清蛋白蛋白提取率的影響見圖7。

圖7 時間與溫度交互作用對苦蕎清蛋白蛋白提取率的影響Fig.7 Effect of time and temperature interaction on the buckwheat albumin extraction rate

由圖7的響應面圖可知，當溫度不變時，隨著時間的增加，蛋白提取率先增加后減小；當時間不變時，隨著溫度的增加，蛋白提取率呈先上升后下降的趨勢。在圖7的等高線圖中，等高線橢圓不明顯，接近圓形，溫度與時間兩因素之間的交互作用對響應值的影響不顯著，與方差分析結果一致。

2.7 驗證試驗

據所建立的數學模型進行參數最優分析，得到最佳預測工藝條件為：料液比1∶19.48（g/mL）、時間59.84 min、溫度35.05℃，在此條件下得出的蛋白提取率為36.16%。考慮實際操作把條件更改為料液比1 ∶20（g/mL）、時間 60 min、溫度 35℃，在此條件下，得出蛋白提取率為35.86%，與預測值36.16%接近，說明該模型能較好地預測實際蛋白提取率。

3 結論

本研究結果表明，在單因素試驗基礎上，采用三因素三水平的響應面分析方法，以料液比、攪拌時間、攪拌溫度為試驗因素，以清蛋白提取率為響應值。試驗中苦蕎麥水溶性清蛋白的最佳提取工藝條件為料液比 1 ∶20（g/mL），攪拌時間 60 min，攪拌溫度 35 ℃，在此條件下蛋白提取率為35.86%。苦蕎麥蛋白是調節人體生理功能的良好食品，食品界與醫藥界都有相關研究，且日益受到人們的關注。本研究結果為解決苦蕎麥在食品和醫藥界的應用提供思路，為高效制備苦蕎麥清蛋白提供一定的依據。