軟骨再生的研究進展

杜艷平，孫永琨

(新鄉醫學院，河南 新鄉 453003)

由于軟骨沒有神經組織和血管，一旦軟骨組織受到損傷，缺損面積較小時依靠機體自身修復可以填充空隙，但不可能完全恢復軟骨的正常結構。而當缺損大于3 mm時，即無法自行修復。因此，再生受損的軟骨備受關注，具有很大的技術發展潛力。對于軟骨再生的研究主要集中在三個方面[1-4]：(1)誘導軟骨的自然愈合過程，如微骨折術；(2)移植能生成軟骨的細胞或組織，比如骨膜、軟骨膜 、骨軟骨或軟骨細胞等。(3)軟骨組織工程技術。

1 微骨折術

微骨折術是一種新型的微創手術，借助關節鏡直視作用，對軟骨缺損位置進行定位，采用刨刀清除關節中已經鈣化的軟骨。觀察無問題后，采用微骨折尖椎，在骨板上進行鉆孔，骨髓和血液從孔中滲出，形成血液凝塊，里面含有的干細胞可以分化成纖維組織、纖維軟骨或者類透明軟骨構成的替代性組織，修復原有受損的軟骨[5]。理查德·斯蒂德曼博士(Richard Steadman)在20世紀80年代和90年代初完善了這一手術，并且通過在馬上進行的實驗研究，逐漸改進了治療方法。后來專業運動員開始注意到這種技術，專業運動員約翰·斯托克頓和安芬尼·哈達威均在手術取得成功后兩個月重返賽場，但兩人手術效果卻完全不同。斯托克頓打球到退役，而安芬尼很快又受傷了，并接受了第二次手術。目前的統計數據顯示，45歲或45歲以下的患者有75%至80%的成功率。

微骨折術操作簡單、損傷較少，治療小面積軟骨缺損的效果優于大面積軟骨缺損，軟骨缺損的面積為2-4 cm2使用微骨折治療的效果不好[6]。微骨折軟骨修復為纖維軟骨修復，手術后生成的血液凝塊非常脆弱，修復后18個月內即可見軟骨退變[7]。盡管軟骨存在退變現象，但是微骨折術后2年的時候臨床評分在仍然保持在較高水平[8]。

關節鏡下微骨折術在改善膝關節軟骨缺損，保證患者的整體治療效果中起著關鍵作用[9]。這項技術隨著科技進步也在不斷改良，如Stanish等[10]將殼聚糖與自體全血混合填充到微骨折治療的軟骨損傷中，結果發現這種方法有利于增加血塊的穩定性，促進骨髓間充質干細胞向軟骨細胞的分化。另外Sharma等[11]成功應用可注射性水凝膠結合微骨折修復不規則軟骨損傷。

研究報告稱骨髓刺激術在年輕患者中，特別是小范圍損傷的治療效果顯著，而對于年齡偏大者效果欠佳。以微骨折術的形式修復治療軟骨缺損的類型不是透明軟骨修復，而是纖維軟骨修復，極早就會發生退化，所以目前諸多研究致力于發展改良微骨折術。

2 移植能生成軟骨的細胞或組織

2.1 自體骨膜移植

骨膜位于骨表面， 外層為纖維層，內層是生發層。 其中生發層含有很多的細胞成分，它始終保持分化增殖的能力。1982年，Rubak實驗證明骨膜具有向軟骨轉化的能力，后來得到了更多的學者的實驗證實。另外滑膜液為軟骨增生提供營養，將游離的骨膜放入滑膜液中，骨膜完全形成軟骨。

自體游離骨膜移植所取的骨膜以脛骨前方最佳。切取自體骨膜時采用銳性游離， 動作輕柔，防止損傷骨膜內層的生發層細胞。移植的骨膜應與軟骨缺損區的骨面緊密固定縫合。固定骨膜時牽拉程度要適中，若過大會使單位面積上的細胞數量減少，會引起骨膜的撕脫和移位。反之，牽拉程度過小會使骨膜重疊，造成修復組織的不完整[12]。

楊貴勇等[13]在研究中發現骨膜比滑膜和軟骨組織對相關基因表達作用更明顯，是因為骨膜本身含有未分化的間充質前體細胞較多，有分化生長的潛能。李稔生[14]認為自體骨膜移植修復關節軟骨缺損的近期臨床效果良好，但遠期效果不佳。Madsen 等[15]報道了18例膝關節剝脫性骨軟骨炎患者自體骨膜移植后疼痛緩解者僅2例，其中 8 例(44%)術后8年中分別由于活動受限、滑膜炎或骨贅形成而再次手術，認為該方法緩解疼痛的比例小，再手術發生率高。

自體骨膜移植取材有限，骨膜形成軟骨面的能力受多種因素影響，比如年齡、供體的位置、移植的方向等，所以預期治療效果很難確定。

2.2 自體骨軟骨移植

1997年，Hangody首先報道了152例病例，是利用膝關節的非負重區的柱狀軟骨塊植入全層軟骨缺損區治療膝關節全層軟骨缺損，最后獲得透明軟骨，且愈合速度也相對較快，取得了滿意的臨床效果。

Marcacci 等[16]對30例軟骨損傷面積小于 2.5 cm2的患者進行自體骨軟骨移植。7年的隨訪結果表明，對于較小的軟骨損傷，中長期效果良好。Lane 等[17]發現面積小于2 cm2的軟骨損傷的修復效果最好，對面積為2～4 cm2的軟骨損傷也有較好的臨床效果。由于但受供區材料來源的限制，這種方法通常只用于損傷面積較小的患者。另外同種異體軟骨移植來源雖然廣泛，但由于移植排斥反應及疾病傳播的風險，一定程度上受到限制[18]。

2.3 自體軟骨細胞移植

自體軟骨細胞移植是將自體軟骨細胞進行體外擴增后移植到全層軟骨缺損區域的技術[19]。自體軟骨細胞移植術首次實施成功是由1987年瑞典醫學家Peterson等[20]以兔子為模型上完成。1994年瑞典的Brittberg等[21]首次將這一方法運用于臨床治療中。2003年Pavesi等[22]用三維支架負載自體軟骨細胞，修復人關節軟骨缺損獲得較好效果。關節鏡檢96.7%修復基本滿意，主要缺損區修復為透明樣軟骨組織。自體軟骨細胞移植技術的出現，幫助很多軟骨損傷的患者看到了希望。隨著研究的發展，這項技術也在不斷創新。

第一代自體軟骨細胞移植技是在關節鏡下取關節軟骨，分離出軟骨細胞體外培養擴增后，將細胞懸液注射至缺損處，最后覆蓋自體骨膜縫合，這種方法可以修復軟骨損傷的深度超過 6-8 mm[23]，但是也有許多缺點，如細胞懸濁液的外漏，骨膜的增生等，需要關節鏡進行手術切除[24]。

第二代自體軟骨細胞移植技術是用一些生物膜如膠原膜等與周圍組織縫合，而不是用骨膜。研究表明，兩代的臨床療效相似，第二代的并發癥少于第一代[25]。雖然費用比用自體骨膜高，但無需進行二次手術，因此更為經濟[26]。

第三代基質誘導的自體軟骨細胞移植是將體外培養的軟骨細胞擴增，植入Ⅰ/Ⅲ雙層膠原膜的粗糙表面，然后再植，最后使用更具生物相容性的纖維蛋白膠進行粘接，消除了縫合的需要，使手術更容易，而且降低了細胞滲漏的風險[27]。

3 軟骨組織工程技術

20世紀90年代，多學科的發展使軟骨組織工程技術應運而生。構建組織工程軟骨需要滿足三個條件：(1)足夠的正常功能的種子細胞；(2)合適的細胞支架；(3)調節細胞增殖的細胞因子[28-29]。

3.1 種子細胞

種子細胞應滿足以下要求：可以通過無創或微創方法獲得；分裂和增殖能力強；無免疫排斥；可連續傳代；傳代后形態、功能和遺傳物質不發生變化。

首先自體軟骨細胞取自患者本身，沒有免疫排斥，細胞的相容性好，沒有倫理學障礙。然而，自體軟骨細胞是有限的，并且取材部位會有不同程度的損傷。此外，在體外傳代培養后很容易轉化為成纖維細胞。

同種異體種子細胞應用較多的是具有多向分化能力的干細胞，在特定的誘導條件下，可以轉化為軟骨。其中骨髓間充質干細胞、胚胎干細胞均為重要的種子細胞[30-31]。有學者將骨髓間充質干細胞植入軟骨缺損中，移植時未使用任何載體，發現新生組織為透明軟骨。由于其免疫原性低，細胞生命周期長，細胞分裂能力強，因此受到越來越多的關注。另有學者在修復關節軟骨缺損時使用骨髓間充質干細胞結合I型膠原，結果植入的骨髓間充質干細胞轉化為軟骨細胞，表面細胞形成透明軟骨組織。

此外，間充質干細胞來源的細胞外囊泡(EV)可促進軟骨再生，并且降低了異常分化或腫瘤轉化的風險，被認為是干細胞移植的替代品[32]。也有很多相關實驗采用多種細胞共培養的方式，成本較低、效率較高，包括有成骨細胞與干細胞共培養體系、成骨細胞和軟骨細胞共培養體系、以及軟骨細胞與干細胞共培養體系等[33-36]，共培養體系中細胞種植比例不同會對研究結果產生各種不同的影響。

異種細胞是從動物組織中獲得的細胞，來源廣泛，能滿足大規模生產的需要，然而，具有一定的免疫風險性[37]。目前，轉基因模型已經建立，如果能夠免疫反應及人畜共患疾病，異種細胞可以成為種子細胞。

3.2 支架

軟骨組織工程技術的支架相當于細胞外基質，應無毒，不引起炎癥，孔隙率高，能為細胞生長提供良好的微環境，植入后仍能保持形狀[38]。

最早用于軟骨組織工程的支架材料是PGA、PLA、PLGA 等[39]。單獨使用 PRP 凝膠作為支架，皮下植入后容易擠壓變形，特定形態的軟骨組織不能形成[40-41]。聚氨酯( PU) 材料可以通過CAD/CAM技術制成具有特定形態的多孔支架[42]。Algul 等[43]利用殼聚糖、海藻酸鹽、β—磷酸鈣制備了三層支架，動物實驗結果表明促進了軟骨缺損再生。另有利用 PRP 和軟骨細胞混合物置于PU支架中激活形成凝膠結構，在裸鼠皮下可以構建具有特定形態的軟骨[44]。改性后的天然高分子凝膠材料能夠促進軟骨細胞的增殖和分化，甚至可以作為生長因子等的緩釋載體[45]。3D打印技術可以用于制備高精度的支架[46-48]，采用低溫沉積3D打印技術制備PLGA/DACECM 組織工程軟骨支架[49-50]，結果表明支架沒有細胞毒性，且具有優異的性能[51]。Lin 等[52]研究也證實這種支架能更好地促進骨髓間充質干細胞的增殖能力，促進新生軟骨的形成。

通過整合制備工藝，構建既能募集內源性干細胞，又有利于新生組織成熟，仿生軟骨天然微環境及微結構的組織工程軟骨支架將是研究的新方向[53]。

3.3 生長因子

生長因子的作用廣泛，在軟骨組織工程中發揮著重要的調節作用，能夠誘導軟骨分化[54]。多種生長因子協同作用能增強軟骨再生的能力[55]。合適的刺激因子可以誘導軟骨定向分化，例如轉化生長因 子(TGF-β)[56]、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)[57]、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)[58]、血小板衍生生長因子(PDGF)[59]及肝細胞生長因子(HGF)[60]。有些生長因子能抑制組織工程軟骨吸收，如轉化生長因子-β1[61-62]。軟骨細胞處于存在多種生長因子的微環境中，這些生長因子相互協同作用可促進軟骨基質的合成，比如bFGF和IGF-I、bFGF和TGF-β[63]。研究表明，聯合應用多種生長因子的效果明顯好于單一一種[64]。Moussa 等發現應用富血小板血漿(PRP)細胞治療促進了軟骨細胞的增殖，有助于軟骨修復。富血小板血漿(PRP)含有豐富的 PDGF、IGF-1和TGF-β等生長因子，已經廣泛應用于運動損傷的治療[65-66]。

4 展望

患者年齡不同，關節軟骨缺損程度各異，那么如何選擇相應的治療方法。針對這個問題，有如下建議：若患者年齡在45歲以下，軟骨缺損面積在2 cm2以內，可采用微骨折術。若患者損傷面積大于2 cm2，由外傷或剝脫性骨軟骨炎引起，年齡在 15～55 歲之間，并且無系統性感染可進行細胞移植療法。由于組織工程技術需要支架材料，治療費用相對高，臨床效果好，不受缺損面積影響，術后需較長時間的康復訓練，若患者能滿足相應條件，可考慮使用。根據傳統理論，磨損的軟骨不能再生。經過多年的研究和積累，促進軟骨組織再生的方法逐步發展，取得了一定的成績，但目前修復軟骨缺損的臨床治療僅是姑息性的，還有許多問題有待解決。例如，影響軟骨再生的因素有哪些？修復的最佳材料是什么？體外培養擴增的細胞是否有惡性轉化的可能性，生物支架材料是否有毒性和致敏性，療效是否確定，如何建立組織工程軟骨產業化的質量標準。面對軟骨再生的困難和未來的挑戰，其臨床應用前景受到廣泛關注。相信隨著多學科的融合，這些問題將逐漸得到解決，并將出現更多的軟骨再生新技術[67]。