大鼠心肌細胞的分離鑒定以及培養

孟憲玉，楊曉敏*

（1.內蒙古科技大學包頭醫學院研究生院，內蒙古 包頭 014010；2.內蒙古包頭醫學院第二附屬醫院心內科，內蒙古 包頭 014000）

引言：大鼠心肌細胞的分離鑒定以及培養工作已經有五十多年的歷史，但是心肌細胞的分離、鑒定、培養上還存在一定的局限性。在這樣的情況下，加強對分離培養技術的探索，有效延長心肌細胞的生長、存活的時間，可以為心肌細胞的研究工作提供更好的研究樣本，為國家的基因研究做出貢獻。

1 試驗材料

為了保證得到的結果科學有效，試驗中選擇了某大學醫學院實驗動物中心提供的健康大鼠，同時準備了Sigma公司的I型膠原酶、胰蛋白酶、Na2ATP，MgATP、阿糖胞苷等分析材料。除此之外，還準備了無鈣Tyrode液、正常Tyrode液、酶液、細胞保存液，并且用NaOH將這些液體的pH調節值至7.38，為了保證細胞培養工作的順利進行，在試驗前還采用了GIBCO公司的優級胎牛血清（FCM）和DMEM/F12培養基等材料。

2 試驗方法

2.1 單個心肌細胞的分離

本文采用酶消化法分離單個心肌細胞，在進行心肌細胞分離的過程中，首先，要讓大鼠脫臼昏厥。朝大鼠腹腔內注射肝素500 U/kg，五分鐘后大鼠就會在肝素的作用下昏厥。其次，要取出大鼠心臟。用剪刀剪開大鼠胸腔后，讓心臟充分暴露出來，并且將心臟劍俠，放置在4℃的生理鹽水中清理。再次，要對大鼠心臟進行灌流。采用心臟離體灌流裝置，對心臟主動脈進行逆行插管并且縫線扎緊，同時用還要對其進行預熱，當溫度在37℃時，就可以正式進行主動脈逆行灌流。需要注意的是在這個環節中，要保證灌流速度在9～10 mL/min范圍內。逆行灌流的過程中，涉及無鈣Tyrode液、正常Tyrode液、酶液這三種液體，液體順序、時間各不相同，其中酶液最后灌注且灌注時間最長。最后，要完成保存處理。在完成灌流后，剪下心室保存在準備好的細胞保存液中并剪碎，需要注意的是，至少要靜置一小時后，才能夠應用到細胞實驗中，在一小時內，心室碎片在室溫下可以更好完成復鈣任務。

2.2 細胞記錄方法和形式

在室溫保存一個小時后，大鼠心室肌細胞就可以放置在正常勝利濃度鈣中，想要具體檢測耐鈣心室肌細胞個數，可以通過高倍或者低倍鏡，計算得到桿狀細胞總數以及球形細胞總數，然后利用桿狀細胞總數除以上述兩種細胞之和，就可以得到具體的個數數據。

2.3 心肌細胞的培養觀察

除了要對細胞進行分離的之外，還要對細胞進行培養觀察，最佳的傳代培養時間在細胞生長增殖至培養板的80%～90%這一階段。首先要將培養液吸去，利用無血清的細胞培養液對細胞進行沖洗，一般情況下要沖洗2～3次；其次要在每個孔內添加0.25%的胰蛋白酶200 μL，等待3～5分鐘，待細胞的完全消化吸收后，在進行下一階段的操作；再次在每個孔內加入20%的FBSDMEM/F12培養液，在這個過程中，要將細胞吹起并打勻，然后就可以按照1：2的比例進行傳代培養工作；最后，將得到細胞的放置在溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養箱內，培養24小時后，將20%的FBSDMEM/F12培養液更換為10%的FBSDMEM/F12培養液。經過上述處理后，就可以利用顯微鏡觀察大鼠心肌細胞的成長狀態和形態特征，需要注意的是在觀察的過程中，要實時測定大鼠心肌細胞的搏動次數。

2.4 心肌細胞的化學鑒定

本文以免疫組織化學鑒定過程為例，在實際鑒定過程中，一共分為四個環節，第一個環節，將大鼠心肌細胞分離、培養后得到的細胞放置在0.25%胰蛋白酶中，讓其消化、吹散；第二個環節，待細胞消化吹散后，將其移入6孔板中，并且在孔板內設置無菌蓋玻片，進而將溫度為37℃、濃度為5%的二氧化碳培養箱內；第三個環節，靜置48小時后，無菌蓋玻片上會長滿細胞，將蓋玻片去除放入平皿中，加入固定液，固定25分鐘后利用PBS反復沖洗3次，每次控制在3分鐘左右；第四個環節，按照順序，依次對無菌蓋玻片滴加科學設計的濃度配比的過氧化酶阻斷溶液、羊血清、ɑ-actin抗體、生物素標記羊抗小鼠抗體、鏈霉菌抗生物素、過氧化物酶溶液，每次滴加液體后，都要在室溫下孵育10分鐘，其中ɑ-actin抗體較為特殊，需要孵育60分鐘，最終加入新鮮配制的DAB顯色液并且完成封片后，就可以進行觀察[1]。

3 試驗結果

3.1 形態學觀察

按照具體的步驟完成試驗過程后，將得到大鼠心肌細胞倒置在顯微鏡下進行觀察，記錄不同時間節點下，大鼠心肌細胞的生長和形態狀態，結合大鼠心肌細胞的搏動次數，最終得到了不同培養時間后（8小時、24小時、48小時、72小時、96小時、120小時、7～10天、40天、45天）在倒置相差顯微鏡下觀察原代培養心肌細胞。8小時后，細胞就會逐步的貼壁生長；24小時后，細胞均已貼壁，并且從圓形或卵圓形轉變扁平形、梭形，還有部分細胞會呈現出三角形，且頂部較為突出。48小時后，研究人員發現，細胞出現了自發性脈搏搏動，雖然整體搏動節律較為緩慢，但是搏動持續，每分鐘平均搏動8～10次；72小時后，細胞逐漸生長開，搏動也日益明顯，可以達到每分鐘60次，部分細胞會伸出偽足，形狀從扁平形、梭形、三角形，變為不規則星形，可能會出現多個、單個細胞核，但是單個細胞核的情況較多，細胞核為原型，核仁較為清晰；96小時后，大部分細胞都會生出偽足，且較為清晰民享，細胞搏動頻率更加明顯，的平均次數增加，絕大部分細胞都會變成不規則星形。120小時后，細胞形成細胞簇，細胞簇會出現同步搏動的情況。7～10天后，就可以開始傳代培養，每三天開展一次傳代培養，細胞逐漸成熟。40天～45天，開始逐漸出現細胞變性死亡的情況[2]。

3.2 檢測的結果

經過間接免疫熒光檢測以及免疫組織化學鑒定的情況來看，通過陰性對照結果來看，加入cTnT抗體的小鼠心肌細胞在胞膜和胞漿中均呈綠色熒光，也就是說，cTnT抗體呈陽性。同時根據免疫組織化學鑒定的情況來看，心肌細胞的分離培養在七天后，就進行了ɑ-actin抗體檢測，檢測結果呈陽性反應，肌原纖維較為清晰。綜合這兩種鑒定檢測結果可以得出，大鼠心肌細胞分離培養的過程中，生物特性不會發生改變，受到一些生長因子的影響，一些細胞在離體后可以存活40～120天，部分生長力較為旺盛的細胞可以持續培養1年左右。也就是說大鼠心肌細胞分離培養可以在細胞學、動物學、生物化學、免疫學中得到應用，還需要注意的是，因為本文采用的是酶消化法分離單個心肌細胞方法，除了這種分離培養方法之外，還有很多其他的方法，這些方法各具優缺，因此要根據實際需求，科學的選擇分離培養方式，比如：消化培養法在實際應用中，雖然操作便捷，但得到的細胞較少[3]。

總結：綜上所述，通過對大鼠心肌細胞分離培養鑒定研究，對大鼠的心肌細胞有了全面的了解，作為生物醫學實驗研究中最常使用的品種，在日后還需要進一步加強對其的研究分析工作。