肝竇內皮細胞在非酒精性脂肪性肝病發病過程中的作用

楊 婧， 高 紅， 趙耀偉， 王 銳

黑龍江中醫藥大學 基礎醫學院， 哈爾濱 150040

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝(NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關肝硬化，表現為脂肪變性、肝細胞損傷、炎癥和不同程度的纖維化。肝硬化由肝纖維化發展而來，是所有慢性肝損傷的嚴重病理階段。肝纖維化和肝硬化涉及細胞外基質的過量產生，而細胞外基質與肝竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell,LSEC)密切相關。受損的LSEC可合成TGFβ和血小板衍生生長因子，激活肝星狀細胞(HSC)，促進細胞外基質的合成[1]。隨著肥胖的增加以及相關代謝綜合征的出現，NAFLD如今已成為歐美等西方發達國家和我國富裕地區慢性肝病的重要病因，估計全球患病率為25%[2-3]。最近的一種建模方法估計，美國的NAFLD病例將從 2015年的8300萬(相當于約25%的人口)擴大到2030 年的1億，相當于超過33%的人口。 重要的是，患有代謝綜合征和NASH的患者在沒有肝硬化的情況下也會發展為肝細胞癌(HCC)[4]。

肝臟內皮細胞主要由LSEC組成，它們是存在于內臟脂肪組織和腸道血液之間的高度特化的內皮細胞。LSEC在人體中具有獨特的表型， 因為它們缺乏基底膜并且具有組織成篩子的多個窗孔，其調節跨越竇狀隙的大分子(包括脂質和脂蛋白)的轉運。LSEC作為肝臟的重要生理結構，與NAFLD相關性的研究被提上日程，并逐漸成為研究熱點，有望成為治療NAFLD發展的突破點，為其提供強有力的生理依據。本綜述將特別關注LSEC在NAFLD病理生理學中的作用。

1 LSEC概述

LSEC來源于骨髓造血祖細胞分化的內皮細胞，是肝非實質細胞的主要細胞群，具有高度專業化。由LSEC構成的肝竇壁是全身毛細血管壁唯一缺乏基膜的毛細血管，約占肝細胞的15%～20%，但僅占肝體積的3%[5]。窗孔是LSEC最具特征性的結構。它們有一個不連續的結構，這意味著腔質膜和無瘤質膜的融合發生在細胞連接的其他部位，這個區域稱為“芬瑞斯特”。盧艷嫻等[6]通過尾靜脈注射脂多糖誘導小鼠急性肝損傷模型，檢測血清中AST、ALT、NO的水平,比較肝組織中小窩蛋白-1的表達情況及LSEC窗孔的改變情況。發現丹參多糖能降低血清中AST、ALT、NO水平，減少小窩蛋白-1的表達，增加LSEC的數目，并使其窗孔孔徑增大，進而達到保護肝臟的作用。

在生理條件下，LSEC是肝臟穩態的守門者，它通過阻止Kupffer細胞和HSC活化以及調節肝內血管阻力與門靜脈壓力來顯示抗炎和抗纖維化特性。在病理條件下，LSEC在慢性肝病的發生發展中起著關鍵作用。 在NASH階段，改變的LSEC釋放炎癥介質并促進炎癥細胞的募集，從而促進肝損傷和炎癥。改變的LSEC也不能維持HSC靜止并釋放纖維化介質，包括Hedgehog信號分子，促進肝纖維化。肝臟血管生成在NAFLD中增加并且有助于肝臟炎癥和纖維化，也有助于HCC的發展。成熟的LSEC在正常情況下可以自行增殖，當LSEC祖細胞占正常嚙齒動物肝臟LSEC的1%～7%時，可能對LSEC的再生有貢獻[7]。骨髓來源的LSEC祖細胞不參與正常肝臟的LSEC轉換,相比之下，肝損傷后，這些細胞是肝再生的主要驅動力。

血管內皮代表血液和其他組織之間的界面，不僅是一個物理屏障，而且參與了不同的生理和病理過程，包括止血、血栓形成、代謝物的運輸、炎癥、血管生成和血管張力 。譚朝輝等[8]將雄性 Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組、逍遙散組和氟西汀組并誘導大鼠抑郁樣行為，發現逍遙散可顯著增加大鼠糖水消耗、爬格數和直立數，顯著降低血清 TNFα、 IL-6 水平， 增加窗孔數量與大小，改善肝竇內皮血管化傾向。 研究表明逍遙散可顯著改善大鼠抑郁樣行為，可能與其降低炎癥因子、改善肝竇內皮功能作用有關。

肝竇有雙重血供，接受門靜脈血流(70%)和肝動脈血流(30%)[9]。血壓在竇內平衡，然后將血液排入肝靜脈和下腔靜脈。盡管消化導致肝臟血流量發生了重大的晝夜變化，但健康人的肝靜脈壓力梯度仍保持在4 mm Hg或以下，證明肝血管張力有很好的調節作用[10]。肝內剪切應力被認為是肝血流調節的主要驅動因素[11]。

在正常條件下，就像其他血管床一樣，內皮細胞在肝臟中能夠產生血管舒張劑，以應對增加的剪切應力，從而減緩血壓的升高，這種特性的喪失稱為內皮功能障礙。內皮功能障礙發生在慢性肝病的早期，甚至在纖維化和炎癥發生之前，并在晚期肝硬化中持續存在。長時間剪切應力誘導的內皮細胞特異性轉錄因子——Kruppel樣轉錄因子2介導剪切應力的這種作用[12]。Kruppel樣轉錄因子2可誘導包括NO在內的血管擴張劑的內皮增生[13]。經研究[14]證明，LSEC是正常肝臟中NO的主要來源，通過剪切應力激活內皮型一氧化氮合酶(eNOS)。

2 LSEC與NAFLD的相關性

2.1 LSEC的特異性

2.1.1 肝竇毛細血管化 LSEC的毛細血管化，也稱為去分化，發生在動物模型和患者肝臟損傷后[15-17]。在肝竇毛細血管化形成初期，吞噬細胞可在外界病理刺激因素作用下活化，并轉移至肝血竇，在吞噬細胞的浸潤下，肝血竇逐漸變窄,甚至堵塞。同時，吞噬細胞會導致內皮細胞窗孔數量減少及孔徑減小，從而加速肝竇毛細血管化的進展[18]。肝竇毛細血管化時，肝血竇內一些細胞及細胞外間質成分將發生一系列改變。有學者[19-20]指出,HSC活化與肝竇毛細血管化的形成密切相關。毛細血管化是一個早期事件，因為它先于HSC和Kupffer細胞的激活與肝纖維化的發生，提示毛細血管化可能是纖維化發生的一個必要的初步步驟[16,21-22]。簡而言之，LSEC只要分化就能保持HSC的靜止狀態，從而使分化的LSEC成為纖維化的守護者[23-24]。事實上，在實驗模型中，體內LSEC分化的恢復促進了輕度纖維化的消退[23,25]。然而，盡管肝硬化消退，竇狀毛細血管仍然存在。因此，在這種情況下，LSEC的分化并不是纖維化消退的關鍵[26]。研究[27-28]表明，肝竇毛細血管化可導致肝臟組織供血動脈化，從而導致肝硬化的形成以及后續的肝癌發生。

謝知兵等[29]通過扶正化瘀方藥物粉末以0.46 g/kg大鼠體質量的劑量配制成懸液，給予三組SD大鼠灌胃，觀察不同條件下體外傳代的LSEC vWF和CD31的蛋白表達情況，發現扶正化瘀方可抑制LSEC vWF和CD31的表達，增加細胞表面的窗孔結構，具有潛在的逆轉肝竇毛細血管化的作用。

2.1.2 肝血管再生 血管生成的定義是從原有血管中發展出新的血管。肝血管生成發生在肝纖維化過程中，這兩個過程密切相關。肝纖維化促進血管生成，而肝血管生成又加重肝纖維化。魯軍等[30]通過分離正常大鼠 HSC、LSEC和肝纖維化模型大鼠 LSEC，利用慢病毒轉染得到血管內皮生長因子 (VEGF) 過表達 HSC。研究表明疏肝健脾活血方可能通過下調VEGF蛋白表達，進而抑制VEGF信號通路，恢復 LSEC窗孔結構，從而逆轉肝竇毛細血管化。此外，LSEC還通過釋放血管分泌信號來平衡肝臟再生和調節纖維化。

2.1.3 炎癥和感染 LSEC通過兩種方式調節肝臟炎癥。首先，LSEC是將血液從肝臟中分離出來的屏障，因此限制或允許循環白細胞進入肝臟組織。LSEC表達細胞間黏附分子-1和血管黏附蛋白-1，使白細胞與內皮細胞黏附。炎癥過程中，細胞間黏附分子-1、血管細胞黏附分子-1和CD31的表達增加，導致白細胞的跨內皮遷移。第二，LSEC對淋巴細胞行為有調節作用。在生理條件下，LSEC抗原遞呈可誘導CD8細胞耐受[31]。LSEC還能誘導T淋巴細胞分化為免疫抑制調節性T淋巴細胞，在體外和體內均具有功能[32]。在炎癥條件下，LSEC也具有抗炎作用，因為它們通過Notch途徑增加輔助性T淋巴細胞1中抗炎細胞因子IL-10的表達[33]。

此外，LSEC是病原體攻擊的靶點。由于其具有的清除能力，LSEC可以通過表面凝集素的表達而捕獲循環病毒，進而使肝細胞受到感染，如HBV和HCV[34-35]所觀察到的那樣。同時，LSEC也可以被細菌感染，如研究[36]顯示，LSEC中的Bartonella桿菌與血管瘤病和脂溢性肝炎有關。

總之，LSEC具有獨特的高滲透性表型，允許某些分子和細胞傳代，但不是所有的分子和細胞。它們通過毛細血管化、血管再生及炎癥和感染等多種致病因素，參與了NAFLD相關疾病的發生和發展。以上LSEC所表現出來的特異性可能會限制與全身給藥相關的副作用，同時為相關肝病的治療帶來新的希望。

2.2 LSEC在NAFLD中的作用

2.2.1 LSEC與NAFL LSEC在正常肝臟脂質轉移中發揮著作用，而存在于循環中的膳食脂質必須通過血管內皮轉運才能被組織所代謝。在生理條件下，LSEC是血液和肝實質之間雙向脂質交換的主要調節劑。

LSEC毛細血管化在NAFL中發生并促進肝臟脂肪變性，伴隨著形態和功能的變化。最顯著的表型變化之一是窗孔的損失，也稱為脫殼或血竇毛細血管化，與在LSEC的近腔表面上形成基底膜有關。

血竇毛細血管化的觸發因素尚未完全確定，但過量的膳食常量營養素，包括脂類、碳水化合物和腸道微生物群衍生產品，都會發揮作用。無菌小鼠菌群移植實驗[37]證實，腸道菌群與NAFLD存在因果關系。Cogger等[38]發現不同飲食喂養的小鼠會表現出不同的常量營養素和能量含量，并表明LSEC窗孔(頻率、孔隙度和直徑)與循環游離脂肪酸(FFA)水平之間存在負相關, 同時其在過量脂質暴露后會發生脫落的現象。

2.2.2 NASH中的LSEC LSEC有助于NASH的氧化應激，在脂毒性反應中，肝細胞產生活性氧并引發強烈的炎癥反應，加劇肝損傷[39]。 實際上，活性氧不僅在肝細胞中檢測到，而且在NASH患者的竇狀細胞中也被檢測到[40]。因此，在NASH中，活性氧產生不僅發生在肝細胞中，而且在一定程度上發生在 LSEC中，并且似乎有助于肝細胞損傷。

LSEC在NASH初始階段的抗炎作用由簡單的脂肪變性進展為脂肪性肝炎，伴隨著白細胞與竇內皮的黏附，隨后白細胞浸潤在肝實質內形成炎性病灶[41]。中度和消退的炎癥反應對肝臟有益，因為它們促進體內平衡的重建， 促進組織修復并發揮肝臟保護作用[42]。 然而， 如在NASH中所見，慢性炎癥導致肝細胞死亡并導致肝實質損傷[43]。在生理條件下，LSEC構成調節肝實質內循環白細胞進入的屏障，并發揮抗炎作用[32,44]。在NAFLD進展的早期階段，一些證據[45-46]表明LSEC也表現出抗炎功能。事實上， Tateya等[46]證明了來自LSEC的NO在短時間(8周)喂食高脂肪飲食的小鼠中抑制 Kupffer細胞活化。在體外，短時間(16 h)暴露于FFA的人和鼠LSEC均可表現出下調的促炎性趨化因子，并通過MAPK依賴途徑參與單核細胞和巨噬細胞募集[45]。脂肪變性過程中脂質過多可導致LSEC功能障礙。體外實驗[47]表明，用氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激人原代LSEC，它會通過ox-LDL受體即凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體1(LOX1)下調eNOS的表達。

LSEC在NASH的晚期階段促進肝臟炎癥，但LSEC的改變發生在NAFLD進展的早期階段。實際上，LSEC毛細血管化先于 Kupffer細胞活化而出現，同時，LSEC毛細血管化和功能障礙也會促進肝臟炎癥。在NALFD進展期間，LSEC最終會表現為促炎表型和功能障礙的轉化。

2.2.3 LSEC與NASH相關的脂肪性肝纖維化 肝纖維化定義為肝實質中細胞外基質的過度沉積，導致肝纖維化的主要機制是肝細胞損傷和炎癥引起的并且由HSC活化介導的長期傷口愈合過程。HSC的激活與增殖是肝纖維化發生的中心環節[48]，同時，HSC是接近LSEC的非實質細胞，它在Disse腔中可儲存視黃醇，并且在肝損傷和炎癥反應期間將其表型轉變為活化的肌纖維母細胞狀態，分泌大量細胞外基質化合物。如上所述，LSEC是NASH中肝臟炎癥的主要效應物，因此也促進肝纖維化。

在NASH中，膨脹的肝細胞產生Hedgehog分子，因此很有可能在NASH期間，Hedgehog 配體被肝細胞和LSEC釋放，從而通過自分泌和旁分泌作用激活LSEC本身以及靜止的HSC。繼而活化的HSC分泌Hedgehog分子，促進LSEC毛細血管化，這反過來有利于HSC活化，促進纖維化過程。夏雪皎等[49]通過采用CCl4腹腔注射建立肝纖維化大鼠模型后分離LSEC，同時收集正常大鼠HSC和 LSEC以作對比。研究發現，健康的LSEC可以維持HSC的靜止狀態，但毛細血管化的 LSEC失去了這種能力，然后在肝纖維化發展的過程中出現毛細血管化和HSC活化之間的惡性循環。

在NAFLD過程中，LSEC功能障礙可以促進肝纖維化內皮功能障礙，并且在NASH動物模型中出現纖維化。表明肝竇內皮功能障礙導致肝纖維化。趙士峰等[50]提出川芎嗪可能通過改善病理性血管生成發揮抗肝纖維化作用的假說，并用腹腔注射CCl4的方法建立大鼠肝纖維化模型，預防給予川芎嗪(100 mg/kg)處理和應用VEGF-A構建原代小鼠LSEC促血管生成模型。該研究表明，川芎嗪能夠通過抑制病理性血管生成從而改善化學誘導的肝纖維化，同時，研究明確了川芎嗪抑制肝纖維化過程中肝竇血管生成的分子機制，為靶向Hedgehog通路的抗肝纖維化新藥研發提供理論與實驗依據。

2.2.4 LSEC在NASH誘導的HCC中的作用 在大多數情況下，HCC在慢性肝病的背景下發展而來(占所有患者的70%～90%)。患有代謝綜合征和NAFLD的患者在沒有潛在的肝硬化情況下也會發生HCC，這表明NAFLD具有特異性的致癌途徑[51]。

發育不良結節優先通過門靜脈接受血液供應，類似于肝硬化再生結節，隨后，血管生成會導致一個高度血管化的結節甚至腫瘤，并促進腫瘤的發生發展和轉移。在NAFLD中，血管生成受到高度刺激并促進NAFLD相關的HCC，因為各種血管生成抑制劑都可以預防HCC的發展。

在肝癌進展中，內皮細胞逐漸失去穩定素-1、穩定素-2、Lyve-1和CD32b等，小鼠肝癌模型和人肝癌模型中均有觀察到類似現象[52]。此外，與健康人的肝LSEC相比，人肝癌內皮細胞具有較高的整合素表達，低表達細胞間黏附分子-1，并表現出更高的血管生成、促凝和纖溶能力，進而表明肝癌與腫瘤內部和周圍內皮細胞的變化有關。

3 總結與展望

即使對于LSEC在NAFLD中作用的研究已經在過去幾年中取得了進展，但仍存在一些問題。首先，導致NAFLD中LSEC發生改變的首發因素大多是未知的，需要進一步的探討和研究。 其次，需要確定NAFLD內皮變化的機制，包括毛細血管化，這可能為NAFLD提供新的治療靶點。第三，LSEC在NASH相關性肝硬化中的作用尚未得到具體驗證。LSEC功能和表型是否與其他原因相關的肝硬化有關仍有待評估。第四，雖然NAFLD被公認為有利于HCC的發展，但仍處于了解LSEC變化如何有利于HCC發展的早期階段。

LSEC作為生理條件下肝臟穩態的守門者。在早期的NAFLD進展中，表現出毛細血管化以及內皮功能障礙，即單純性脂肪變性階段。由脂毒性、脂肪因子、炎癥和腸道微生物群衍生的產物可引發LSEC的變化和能力喪失，進而導致NASH甚至相關肝纖維化的發生和發展。在NASH階段，改變的LSEC有助于肝臟血管生成、炎癥、纖維化和HCC。綜上，改善LSEC的狀況對治療NAFLD具有很大的潛力。當前的挑戰是確定專門針對LSEC以調節其活動的相應策略，從而達到治療NAFLD的理想效果。

作者貢獻聲明：楊婧負責課題設計，資料分析，撰寫論文；高紅、趙耀偉等參與收集數據，修改論文；王銳負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。