多囊卵巢綜合征與生物鐘的研究進展

鄒怡欣，時雨杰 綜 述，劉 煜，劉 暢 審 校

（1.中國藥科大學生命科學與技術學院，南京211198；2.南京醫科大學附屬逸夫醫院，南京211166）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome,PCOS）是一種常見的內分泌異常導致的排卵功能障礙性疾病。據估計，約1/5 的育齡婦女受其影響[1-2]。該病癥在臨床上的表現為：(1)在生殖方面，常表現為稀發排卵或無排卵、不孕、雄激素過多和多毛；(2)在代謝方面，顯示出胰島素抵抗（insulin resistance,IR）、葡萄糖耐量降低、2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM） 以及心血管疾病（cardiovascular diseases,CVDs）多發等癥狀；(3)在心理上則表現為焦慮、抑郁[3]。因持續無排卵，在嚴重情況下PCOS 還會使子宮內膜過度增生，增加子宮內膜癌的風險[4-5]。此外，PCOS 對其他系統也有影響，如還能引發口腔病癥[6]。

一般認為，由PCOS 導致的激素失調主要表現為胰島素和雄激素水平升高。同時，遺傳、環境與其他因素相結合導致內分泌紊亂[7]。生殖神經內分泌功能障礙使促性腺激素釋放激素（gonadotropin releasing hormone, GnRH）、促黃體激素（luteinizing hormone, LH）的分泌頻率和幅度增加，是PCOS 的病理生理機制之一[8]。有研究證明，肥胖、卵巢功能不全和下丘腦垂體軸各水平的功能紊亂也是促成PCOS 的原因。PCOS 患者易發肥胖；反之，肥胖同樣可導致PCOS 的發生[9]。肥胖誘發的代謝紊亂不僅可增加罹患高雄激素血癥（hyperandrogenemia,HA）、多毛癥、不育癥和妊娠期并發癥的風險，還能協同IR 進一步加劇T2DM 和心血管疾病的發生。此外，PCOS 伴隨肥胖癥還可以使IR 惡化，增加CVDs 的患病率[10]。

1 生物鐘和女性生殖功能的關系

在自然界中，從單細胞到高等生物，乃至人類的幾乎所有生命活動均存在著按照一定規律進行的周期性現象，這種生命活動現象稱為生物鐘[11]。以哺乳動物為例，生物鐘控制著各種生理進程，如睡眠周期、血壓、血液激素水平及能量代謝等，使之呈現出大約以24 h 為周期的節律性變化。由于生物鐘的存在，從細胞到器官乃至個體在不同時期，對外界環境的各種理化因子表現出反應性和敏感性的差異。

生物鐘基因在細胞和分子水平上與哺乳動物的生殖生理和生殖內分泌密切相關，流行病學研究表明生物鐘失調的女性更易表現出生殖力低下和不良妊娠的特征。目前人們對生物鐘如何影響生殖的機制尚不清楚，鐘基因的表達與PCOS 臨床病理學特征之間的分子機制也未完全闡明。因此，深入研究生物鐘紊亂與PCOS 發病機制的關聯，可以在臨床中更好地運用時間生物學原理為治療PCOS 服務[12-13]，實現個性化精準醫療。

1.1 生物鐘及其分子機制 晝夜節律由一系列鐘基因的轉錄和轉錄后調控產生的分子振蕩引起，機體內不同水平的生命活動均表現出一定的時間順序性及周期節律性[14]。生物鐘以位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）的中樞振蕩器為主起搏點，其他外周組織為次起搏點。中樞和外周生物鐘共同構成一個完整的調節系統，產生并維持以24 h 為一個循環周期的晝夜波動[15-16]。生物鐘依賴于鐘基因“轉錄-翻譯-加工”的自我調節反饋環路，對其表達和各種生理活動進行調控。核心反饋調節環路如下：核心轉錄因子BMAL1 (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator-like, Arntl)與CLOCK (circadian locomotor output kaput)相互結合形成異源二聚體，隨后在轉錄水平上調控其他鐘基因的表達，例如PER 1/2/3（Period 1/2/3）和CRY 1/2（cryptochrome 1/2）。轉錄結束后，PER 和CRY 在細胞質內進入翻譯階段，當胞質內二者蛋白水平達到一定濃度閾值時，則重新轉位至細胞核，抑制CLOCK/BMAL1 二聚體的轉錄活性，同時PER 和CRY 的轉錄活性也被抑制，由此形成反饋調節[17]。除核心反饋調節環路以外，CLOCK/BMAL1 異源二聚體還可以誘導核受體（nuclear hormone receptors,NHRs）的調節，如RORs（retinoic-acid-receptorrelated orphan receptors, RORɑ/β）和NR1D1/REVERBs (nuclear receptor subfamily 1, group D,member)，二者分別激活和抑制BMAL1 的轉錄[18-19]。

1.2 卵巢生物鐘的調控作用 研究表明，約43%的基因在外周組織中呈現出節律性表達，包括肝臟、心臟、骨骼肌和卵巢[20]。由此可見，除了由SCN 調控的主生物鐘外，各外周器官也存在相應的外周生物鐘。外周時鐘節律與能量穩態之間存在直接關系，且時鐘基因的表達與代謝基因的轉錄活性是可調控的[21]。例如，Kobayashi 等[22]研究發現，胃動脈中雌二醇（17β-estradiol,E2）水平表現出明顯的晝夜節律，且與胃門靜脈E2 水平呈現正相關，與肝臟中Esr1(estrogen receptor ɑ, ERɑ mRNA)的基因表達呈現負相關。由此可以得出結論，血液E2 水平的晝夜節律受控于胃門靜脈E2 的量和肝臟中ESR1 的表達。

卵巢生物鐘在中樞生物鐘的調控下影響排卵并控制類固醇激素的釋放。PER1、PER2 和BMAL1等時鐘基因在大鼠卵巢中的表達具有晝夜節律性，進而調節卵泡和黃體內顆粒細胞和卵泡膜細胞的生理活動。Fahrenkrug 等[23]利用RT-PCR 和免疫組學等技術發現，雌鼠卵巢細胞內生物鐘基因Per1 和Per2 表達具有明顯的晝夜周期性，該研究證明了卵巢生物鐘的存在。同樣，Karman 等[24]通過RT-PCR技術發現核心振蕩器元件（Clock、Bmal1、Cry1、Per1、Per2 等核心生物鐘基因）在卵巢中節律性表達，為發現卵巢中晝夜節律轉錄翻譯反饋環路奠定了基礎。

另外，在下丘腦-垂體-卵巢（hypothalamuspituitary-ovary,HPO）軸的各個水平上均存在生物鐘，而生物鐘的失調，正是導致各種生殖疾病的原因。由此可以認為，PCOS 是由于中樞時鐘和HPO軸上各時鐘不同步導致的。張芹等[25]選取了雌性Rev-erb-α 敲除型（Rev-erb-α-/-）和野生型（Reverb-α+/+）小鼠，分別與雄性野生型C57BL/6J 小鼠交配觀察雌鼠的生理周期，發現敲除型小鼠生理周期延長導致其生殖能力下降，表明生物節律在維持生理周期穩態上扮演著重要角色。馬廣軍等[26]的研究表明，持續光照會降低卵巢雌激素的合成與分泌，并且卵巢顆粒細胞內瘦素受體（leptin receptor,Lepr）的表達受BMAL1 的正向調控，光照周期紊亂會破壞生物鐘系統的穩定，抑制Lepr 的mRNA 表達從而阻斷瘦素對E2 合成的調控作用。Shimizu 等[27]研究發現，晝夜節律基因還與雌性動物的發情周期有關，Per2 和Clock 時鐘基因均能調節卵巢顆粒細胞的功能，PER2 能夠通過刺激E2 的產生和P450的表達增加顆粒細胞黃體酮的生成，而CLOCK 則與PER2 有著相反的調控作用。

主生物鐘主要受光暗周期的調節。SCN 對光線高度敏感，可以接收由視網膜傳入的明暗光線的神經沖動，將其轉化為化學信號，從而調節褪黑素（melatonin,MT）的分泌。MT 隨著光暗的變化呈現晝低夜高的節律，與MT 受體結合引起以24 h 為周期的近日節律的變化。值得注意的是，MT 受體在子宮肌層、卵巢顆粒細胞和黃體細胞[28-29]中均有分布，由此可見，MT 對HPO 軸具有重要的調節作用，主要體現在MT 能促進黃體期卵巢顆粒細胞和黃體細胞中孕酮的合成分泌[30-31]。諸多研究表明，MT 濃度可以影響排卵：經常口服避孕藥的女性群體中，MT 水平在黃體中期和中卵泡期相較于正常群體均明顯偏高，證明在無排卵月經周期內MT 水平是上升的[32]。下丘腦性閉經患者MT 的晝夜水平均明顯高于正常人群，且夜間水平約為正常水平的3 倍[33]。總之，生物鐘的紊亂，會引發MT 合成分泌異常，進而影響性激素的合成，直接導致月經周期異常及生殖系統疾病的發生。

1.3 生物鐘紊亂與生殖系統疾病 生物鐘對機體的影響人的生理功能正常與否和生物鐘密切相關，主要表現在體溫、行為模式上。內源性晝夜節律主要調節以24 h 為周期的生理機能，如體溫、脈搏、呼吸、血壓、激素、酶、血液和組織細胞內的生化反應等，基因功能活動也同樣呈節律性。不同的組織振蕩器對激素都具有調節作用，晝夜節律的變化影響內分泌信號的產生和下游反應的應答，而內分泌信號存在反饋干擾生理和代謝穩態的機制[34]。研究表明，生物鐘基因多態性和環境因素導致的HPO 軸上各水平生物鐘失同步，是一些復雜生殖系統疾病的病因之一。

生物鐘參與控制生殖過程中的排卵、類固醇激素釋放、卵泡發育等生殖生理進程。Alvarez 等[35]的研究指出，Bmal1 基因敲除可導致小鼠不孕不育，且小鼠體內的類固醇合成急性調節蛋白（steroidogenic acute regulatory protein, StAR）功能障礙，類固醇激素合成水平降低，最終導致小鼠的生殖能力下降。Hickok 等[36]發現，生物鐘基因在人GnRH 神經元中存在節律性表達。Smarr 等[37]的研究表明，雌鼠下丘腦前腹側室旁核中Per1、Bmal1 表達呈現出節律性振蕩，從而調控LH 的周期性合成及分泌。可見，生物鐘失調與生殖系統疾病密切相關，研究鐘基因與生殖疾病間的作用機制，將有助于為相關疾病的治療提供更廣闊的思路。王朝霞等[38]通過在裸鼠移植瘤腫瘤組織中導入Per2 基因，證明PER2 可以下調凋亡抑制基因Bcl-2，促進凋亡基因Bax 表達，進而誘發腫瘤細胞凋亡，通過抑制卵巢癌的生長轉移發揮其抑瘤效果。Hideki 等[39]發現Cry1 和Bmal1 與上皮性卵巢癌的臨床病理指標（發病年齡、臨床分期、病理類型和分級）存在相關性，這兩個基因的表達豐度可以代表腫瘤分期和病理分型。另外，子宮內膜癌的發病進程可能與Cry1、Per1、Per2 的CpG 島甲基化引起的生物鐘紊亂有關。

2 生物鐘與PCOS 的關系

時鐘基因變異或被人為敲除則會導致晝夜節律變化、HPO 軸上各水平生物鐘失同步、激素分泌模式改變等多種生理功能的紊亂，會進一步導致相關疾病的發生。流行病學調查表明，女性由于長期熬夜、倒班工作、跨時區飛行等不健康的生活工作方式，正常的晝夜節律受到光暗和時間的影響，致使生殖能力低下和不良妊娠的概率更高[40]。同時，基于卵巢生物鐘在調節女性內分泌代謝中發揮關鍵性作用這一觀點，越來越多的證據顯示晝夜節律紊亂導致女性群體患PCOS 的風險增加。

2.1 PCOS 的發作時辰節律性 PER2 在海馬體突觸可塑性和記憶中發揮重要作用，與神經性疾病阿爾茨海默病密切相關[41-42]。Clock 突變小鼠表現出低胰島素及高血糖血癥[43-44]，與T2DM 及心肌疾病相關[45]。這些研究揭示了生物鐘在行為、代謝及認知等相關疾病方面的重要性。心血管疾病、腦血管疾病，心源性猝死多發生在清晨醒后數小時，這些疾病的發作都可能與夜間較低水平的血壓在清晨覺醒后迅速上升有關聯[46]。因此，了解生物鐘對于疾病發生與發作時間的了解具有重大意義。

光照或生物鐘的紊亂通過影響MT 的合成分泌，導致月經周期紊亂。而PCOS 患者通常在月經時限性、節律周期性和功能狀態性上表現異常：（1）時限異常：有研究發現PCOS 在青春期啟動提前[47]并表現為發育亢進，另外還表現為絕經延遲。（2）狀態異常：PCOS 是原發卵巢的疾病，卵泡功能異常是PCOS 病變的核心[48]，卵泡數量多，E2 濃度高，易發卵巢過度刺激綜合征（ovarianhyperstimulation syndrome, OHSS），即卵巢對促性腺激素的過度應答。（3）節律異常：激素調節下節律性的破壞，如年節律，月節律等[49]。PCOS 患者主要表現為月節律性延長或者消失，月經后期稀發、閉經。PCOS 患者在月經周期的不同時期臨床表現均有所不同：在經后期即卵泡期，卵泡發育過程中數目過多，且卵泡僅能發育至2～9 mm，在卵泡發育的早期即停止生長；在經間期臨床表現為排卵障礙[50]。在月經周期節律中，各種生理水平不停發生節律性變化，生物鐘對于卵泡的發育成熟、排卵起著不可替代的作用。而生物鐘的紊亂，會導致一些女性內分泌疾病的發病率顯著升高。

2.2 PCOS 的藥物時辰治療 PCOS 是一種以持續性無排卵、HA 或IR 為特征的內分泌紊亂綜合征，是無排卵性不孕的重要原因，而促排卵是現今治療PCOS 的主要措施。在此基礎上可以結合生物鐘的晝夜節律進行給藥，遵循人類疾病發生和人體對藥物代謝調節的時間特異性分子機制，進而為不同患者提供最佳的用藥時間以及精準化的治療手段。

關于時辰藥理學[51-52]的諸多研究已經證實，藥物作用與人體生物鐘有著極其密切的內在聯系。在不同的作用時辰上，相同劑量的同種藥物給藥可呈現出差異很大的治療效果。因此，根據機體對藥物的反應節律決定最佳的給藥劑量和時間，考慮藥物的血藥濃度與生物鐘的配合不僅可以提高療效和節省藥物，還能將藥物的不良反應降到最低限度。李偉等[53]在類風濕性關節炎患者C 反應蛋白（Creactive protein,CRP）的濃度隨時間變化且零點前達到峰值的事實基礎上，進一步證實了晚間給藥的用藥效果優于傳統的晨間給藥。胡潔等[54]基于肺癌患者在6 點到12 點時間段內DNA 合成達到高峰的現象而建立小鼠時辰給藥系統，篩選出ZT15（Zeitgebertime 15）是紫杉醇抗腫瘤效果最佳的給藥時間。目前已有證據表明，高分子量制劑治療癌癥的給藥時間受到晝夜血壓波動的影響[55]。對于PCOS而言，相關激素在發情周期存在明顯的晝夜節律：血漿皮質醇值早上比下午高2～3 倍，其最大值出現在凌晨4～8 點之間，最小值出現在下午4～8 點之間；LH 高峰值多數發生在上午8 點，而在排卵前最高峰出現于凌晨4 點[56]；MT 濃度在夜間達到高峰，且受到光照的影響。由此可見，POCS 患者的生理特征及激素水平是呈現周期性變化的，不同的給藥時間會影響藥物的干預效果，依據PCOS 患者相關激素的周期節律確定給藥時間，將是時辰治療學在PCOS 治療中更深層次的應用。

目前，相關治療藥物（例如達英-35、來曲唑、二甲雙胍等）的給藥時間對PCOS 療效差異還沒有進一步的研究。現有結果指出，在月經周期的不同時期給藥會對治療效果有影響。張新平等[57]通過觀察克羅米芬結合人絨毛膜促性腺激素（Human chorionic gonadotropin,HCG）治療PCOS 的研究，分析患者血清胰島素、胰島素抵抗指數的變化證明該藥在一定時期或藥物誘發排卵期間，若能合理得當地掌握時間和藥量，可起到類似黃體生成激素的療效誘發排卵。蘇靜等[58]通過比較在不同時間應用Gn RH 拮抗劑的方案表明，對于基礎LH 較高的PCOS患者，為降低OHSS 的發病率，可以提前使用拮抗劑從而降低血清E2 水平達到減少獲卵數的目的；而采取靈活的拮抗劑方案則能夠獲得較多的卵子。

3 展望

目前的研究還遠未揭示PCOS 的病因學基礎，對PCOS 發病機制的研究主要集中在肥胖、IR、激素失調等方面。越來越多的證據表明生物鐘紊亂是多數生殖疾病的病因之一，但對基于生物鐘的PCOS發病進程的研究卻鮮有報導。通過創新性地提出了生物鐘與PCOS 的關系，擬分析生物鐘紊亂導致PCOS 的潛在發病機制并對PCOS 的時辰治療提出了新的見解與思路。相信隨著研究的深入，可以填補這一領域的空缺，從時辰治療學的角度出發，為PCOS 發病機制及其治療提供更系統、更完善的理論支持，也有助于在臨床中更好地運用生物鐘，以期在精準醫療中發揮重要作用。