蚯蚓在生態毒理試驗中的應用研究

邵將 張宗鵬 謝宇震 孫倫濤 成德久

(安徽理工大學地球與環境學院，安徽 淮南 232000)

土壤安全是人類一直關心的熱點問題，由于其污染不易察覺且危害巨大，近年來，各種用于監測土壤污染狀況、治理土壤污染的方法層出不窮。在這種情況下，以蚯蚓為受試生物，通過監測各污染物對蚯蚓的毒害作用來評價其對生態環境危害程度的方法，即蚯蚓生態毒理試驗[1]得到迅速發展。

蚯蚓在土壤中數量龐大，分布廣泛，更容易與土壤中各種污染物接觸[2]，且蚯蚓的表皮角質層較薄，腺孔發達，對土壤中大多污染物較其它生物更為敏感，能很好地指示土壤污染狀況。此外，蚯蚓活動可以改善土壤結構，緩解土壤污染狀況，對改良土壤污染具有良好的應用前景[3]。由于蚯蚓這些特點，加上蚯蚓易于養殖，容易采集，因此常被用于評價土壤質量與外援污染物對土壤的影響。本文主要就生態毒理實驗常用方法做簡要介紹，同時從蚯蚓的改良作用、蚯蚓個體與微觀指標對污染物的響應機制來闡述蚯蚓在生態毒理實驗中能夠起到的作用。

1 蚯蚓生態毒理學試驗方法

蚯蚓生態毒理試驗研究方法眾多，本文主要就其中的實驗室急性毒理試驗、回避行為實驗、在真實生態系統中進行的田間試驗、生物檢測法和生物標記法[4]進行簡要介紹。

1.1 急性毒性試驗

急性毒性試驗指蚯蚓經1次或短時間內多次給予受試物，通過測量致死和非致死的指標參數，來表征污染物毒性效應[5]。該方法簡單、快速，應用廣泛。目前，急性毒性試驗廣為應用的有以下4種方法。

1.1.1 濾紙接觸法

將赤子愛勝蚓(Eisenia foetida)或安德愛勝蚓(Eisenia andrei)放置于玻璃瓶中(瓶中放有標準化濾紙條)，48h后測定其死亡率，并計算半致死濃度(LC50)[6]。此法簡單易行，效率高，測試效果顯著；但此模式受制于污染物毒性信息只能通過皮膚接觸獲得，對環境中污染物的真實影響反饋難以準確評估。

1.1.2 人工土壤試驗法

在人工土壤中填充濃度不同的污染物，后將具有成熟環帶的赤子愛勝蚓或安德愛勝蚓置于其中，讓其暴露在污染物中，14d后觀察其行為和存活狀況，并計算出半致死量(LD50)[6]。此法較為繁瑣，且人工土壤組分還可能與被測物質發生反應而對試驗結果造成影響。但這種方法可以較為準確地反映出蚯蚓在真實環境中受到污染物脅迫時的反應，從而得出污染物的毒性效應。

1.1.3 人造土壤試驗

這種方法改良了人工土壤試驗中土壤組分的問題，以定形水合性二氧化硅粉和玻璃球(直徑1.5～2cm)代替人工土壤[7]，不僅大大簡化了實驗步驟，還杜決了土壤組分與被測物質發生反應的可能，使實驗結果更為準確。

1.1.4 自然土壤試驗法

該法與人造土壤實驗只有蚯蚓生活基質的差別，采用自然土壤作為生活基質所得實驗結果能更為真實地反映出污染物對環境的影響，但是不同地區自然土壤性質有差別，實驗結果往往不具有可比性。

1.2 田間試驗法

在現實環境中，通過觀察蚯蚓種類、數量和生物量等指標，測定某種污染物質對蚯蚓種群影響的方法[1]。該方法能夠直接反映出污染物在自然界中的影響，但操作繁瑣，耗時較長，且受地域環境限制較大，不同地區可比性較差。

1.3 生物檢測法

通過分析污染物殘留，對比污染區域與未污染區域(土壤類型相同)蚯蚓個體與種群特征，闡明環境污染狀況[1]。該法費用低廉，能夠直接反映出污染物對土壤生物的毒害作用，但是只能在污染發生后評估污染物毒性。

1.4 生物標記法

根據污染物引起的蚯蚓生理、生化、體內細胞和分子指標的變化來判斷污染物環境影響的方法[6]。該方法能夠直觀準確地反應污染物對生物微觀結構的影響，但費用較高，且操作較為復雜。

1.5 蚯蚓回避行為實驗

蚯蚓回避行為實驗是以蚯蚓48h對某一濃度化合物的行為反應來判斷其毒性。該方法省時省力、成本低廉，具有較高的反應靈敏度[8]，而經生物修復后的土壤污染物濃度較低，因此可以通過蚯蚓回避行為試驗來確定污染土壤的生物修復效果。

2 蚯蚓強化污染土壤修復的能力

污染土壤的理化性質惡劣，土壤肥力流失，蚯蚓活動可以改良土壤，提升土壤肥力，改善土壤酸度，而且蚯蚓可以吞吃有機廢物，促進土壤有機物質的礦化。蚯蚓利用其特有的生理功能及其與環境中微生物的協同作用對有機質進行生物降解，將廢棄物中碳、氮、磷、鉀等養分轉化為更利于植物吸收的形態，增強微生物多樣性，降低后續處置難度[9,10]。韓清鵬等發現，蚯蚓活動能夠提高不同土壤中氮素礦化量[11]；俞協治等[12]發現，蚯蚓活動可以提升植物地上部分生物量，在一定條件下，能夠影響部分重金屬的有效性，間接影響植物對土壤重金屬的吸收，降低重金屬危害。

除蚯蚓自身作用外，蚯蚓糞在土壤修復方面也有巨大應用潛力。蚯蚓糞富含有機質和腐殖酸，可以增強地力，減少化肥施用，改良土壤板結；蚯蚓糞富含微生物菌群，對土壤的形成發育、物質循環和肥力演變等均有重大影響；蚯蚓糞中的幾丁質酶產生菌，能夠有效抑制植物性致病真菌[13]，有利于植物生長。有研究發現，蚯蚓糞可以通過提高葉綠素含量來有效地激活作物的光合作用，從而克服壬基酚脅迫對植物生長的影響。因此，蚯蚓糞除了降低土壤壬基酚的生物有效性外，還可以通過增強作物的抗逆性來幫助作物應對壬基酚脅迫[14]。張燁、周東興[15,16]等發現，蚯蚓糞施加可以促進植物生長，提高農作物產量，并顯著增加土壤肥力。

3 蚯蚓個體對土壤污染物的響應

蚯蚓對污染物較為敏感，當污染物濃度達到一定程度時，蚯蚓會出現明顯的回避現象。徐冬梅等[17]發現，蚯蚓對有機污染物與重金屬均會出現回避行為，且回避率與污染物濃度呈正相關。此外，蚯蚓的生長繁殖也會受到污染物影響而產生變化，有研究發現，重金屬會導致蚯蚓體表潰爛[18]，且蚯蚓病變程度與重金屬含量息息相關。還有研究發現，環境中重金屬與有機污染物會使蚯蚓體重有較大程度下降[19,20]，不僅如此，污染物還會對蚯蚓生殖產生較大影響，使蚯蚓產繭量減少[21]，蚯蚓精細胞DNA損傷，精子畸形，并會導致前列腺、雄孔等器官病變[22]。故而，可以通過觀測蚯蚓生理行為指標的變化來評價污染物對生態環境的毒害程度。

4 蚯蚓微觀指標對污染物的響應

外源污染物對蚯蚓微觀指標的影響是當前研究的熱點，由于污染物生物有效性會隨土壤性質變化而變化，而生物對污染物產生的生理、生化反應相對穩定。因此，利用生物的生理、生化反應可以指示污染物在個體水平上對生物的危害，本文主要介紹下面4種微觀指標對污染物的響應。

4.1 蚯蚓體內酶對污染物的響應

污染物對蚯蚓酶影響的研究主要集中在重金屬對抗氧化酶系統的影響方面，抗氧化酶系統對重金屬較為敏感，其活性變化可以很好地反應重金屬的存在狀況。王輝等[23]發現，蚯蚓體內酶活性與重金屬含量及處理時間關系密切，當重金屬脅迫作用較低時，酶活性會因重金屬脅迫上升，但是重金屬脅迫過強，會對酶活性產生抑制作用。可以將抗氧化酶系統對環境污染物的脅迫反應用以指示污染物對環境的毒性效應。

4.2 蚯蚓DNA對污染物的響應

DNA作為生物體最重要的遺傳物質，其穩定性至關重要，DNA具有一定的自我修復能力，但是當外界對DNA傷害過大時，會導致DNA損傷，影響其結構和功能，進而影響生物生存生長狀況[24]。有研究發現[25]，鄰苯二甲酸二乙酯會導致蚯蚓DNA損傷。王作彬[26]發現，殺蟲劑作用導致蚯蚓體腔細胞DNA受到損傷，且DNA損傷程度與殺蟲劑濃度間存在明顯的“濃度—效應”關系。

4.3 蚯蚓溶酶體膜對污染物的響應

溶酶體主要存在于蚯蚓體腔細胞內，而中性紅染料可以在其中積累富集，一旦溶酶體膜受到損害，中性紅就會滲透到細胞質中，導致細胞變色。因此，可以用中性紅染料保留時間來表征溶酶體膜穩定性[27]。武道吉等[28]發現，當蚯蚓受到砷污染時，其溶酶體膜穩定性下降，且溶酶體膜損害程度與砷濃度呈很好的線性關系。故而可用溶酶體膜穩定性來表征污染物毒性效應。

4.4 金屬硫蛋白對污染物的響應

金屬硫蛋白(MTs)是細胞內低分子量、富含半胱氨酸的蛋白質。在真核生物中普遍存在的金屬硫蛋白具有獨特的結構特征，能提供強大的金屬結合和氧化還原能力，保護生物體免受有毒金屬的危害[29]。李超民等[30]研究表明，重金屬脅迫會使蚯蚓體內金屬硫蛋白含量顯著增加，但是重金屬濃度過高，會降低金屬硫蛋白的含量。

5 展望

蚯蚓作為“生態系統工程師”，其在生態毒理試驗中的應用對改良土壤污染、指示土壤污染狀況、揭示污染物作用機理等方面具有重要意義。目前，土壤污染問題愈加嚴重，污染物更加復雜，著重于污染物的復合污染，遷移、污染物累計動態過程等研究對于土壤污染的緩解有重大意義。同時，重點挖掘蚯蚓生物標志物對土壤污染的早期預警作用，蚯蚓對污染土壤的改良作用也將為緩解土壤污染情況貢獻力量。