植物組織培養(yǎng)污染成因分析及防控措施

梁明驊 曾雯雯 陸耀

(廣西玉林農(nóng)業(yè)學(xué)校，廣西 玉林 537000)

植物組織培養(yǎng)是指在無(wú)菌環(huán)境下由人工控制植物的器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體，將其與植物體分離后利用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，使之繼續(xù)生長(zhǎng)并發(fā)育成完整植株的過(guò)程。植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以有效縮短植物的生長(zhǎng)周期，減少生產(chǎn)成本，而且人工控制的培養(yǎng)條件為植物提供了優(yōu)良的生長(zhǎng)環(huán)境，可以有效避免外部因素對(duì)植物生長(zhǎng)的影響。植物組織培養(yǎng)技術(shù)雖然擁有眾多優(yōu)勢(shì)，但在培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常會(huì)產(chǎn)生污染，這種污染不易控制，一旦某個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題就容易使植物組織產(chǎn)生污染，進(jìn)而導(dǎo)致整個(gè)實(shí)驗(yàn)失敗。所以要想減少培養(yǎng)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益，就要做好植物組織培養(yǎng)污染的防控工作。

1 植物組織培養(yǎng)污染的概念

植物組織培養(yǎng)始于20世紀(jì)初,是以植物生理學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的植物種苗繁殖技術(shù)。經(jīng)過(guò)近1個(gè)世紀(jì)的發(fā)展,植物組織培養(yǎng)技術(shù)已在科學(xué)研究和生產(chǎn)實(shí)踐上得到了廣泛應(yīng)用,特別是在植物的工廠化育苗方面。植物組織中含有大量的微生物，其特點(diǎn)是繁殖速度快，生長(zhǎng)周期短。當(dāng)植物組織進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間離體培養(yǎng)時(shí)就會(huì)出現(xiàn)污染現(xiàn)象，植物組織培養(yǎng)的操作并不復(fù)雜，但稍加疏忽就會(huì)引起組織培養(yǎng)的污染。這些污染通常出現(xiàn)在培養(yǎng)基附近，呈現(xiàn)出各種不同形狀大小的痕跡，如霉變、云霧狀、發(fā)酵泡沫狀等。植物組織培養(yǎng)中的污染可能來(lái)自于內(nèi)部因素，如真菌、細(xì)菌、酵母菌等多種微生物，也有可能來(lái)自于外部因素，如操作人員在操作過(guò)程中沒(méi)有按照標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作等。總之，植物組織在培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生污染的原因有很多，操作人員需要根據(jù)具體情況來(lái)分析，然后采取相應(yīng)的防控措施。

2 防控污染的意義

植物組織培養(yǎng)產(chǎn)生的污染有著很大危害性。對(duì)植物組織培養(yǎng)有一定阻礙，如增殖速度降低、生長(zhǎng)速度減緩等，嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致植物死亡，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)失敗，從而增加培養(yǎng)成本，降低企業(yè)的經(jīng)濟(jì)利益。防控污染可以有效促進(jìn)植物組織培養(yǎng)技術(shù)的研究進(jìn)展，構(gòu)建完整的植物試管基因庫(kù)，保護(hù)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中寶貴的樣本數(shù)據(jù)，避免受到污染的危害。另外，植物組織培養(yǎng)中含有大量的珍稀物種，這些物種的價(jià)值很高且獲得不易，降低組織培養(yǎng)環(huán)節(jié)的污染，可以起到保護(hù)珍稀物種的作用。由此可見，防控污染的意義重大，政府、相關(guān)部門及操作人員要重視植物組織培養(yǎng)過(guò)程中的防控工作，加大研究力度，改善操作的不足之處，科學(xué)合理地開展植物組織培養(yǎng)工作。

3 植物組織培養(yǎng)污染的種類

3.1 材料帶菌

材料帶菌是指植物組織從植物體分離時(shí)就帶有病菌，這些病菌可能來(lái)自于植物體的生長(zhǎng)環(huán)境，通常情況下植物體的生長(zhǎng)環(huán)境中都含有大量的微生物，因?yàn)槠錅囟取穸瓤梢詽M足微生物的生長(zhǎng)條件，一般病菌會(huì)分布在植物體的表面或周圍。

3.2 初代培養(yǎng)污染

初代培養(yǎng)污染是指在進(jìn)行第1代植物組織培養(yǎng)時(shí)產(chǎn)生的污染菌。這種污染出現(xiàn)的原因多是由于操作人員在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作時(shí)沒(méi)有按照標(biāo)準(zhǔn)要求進(jìn)行操作，導(dǎo)致病原菌接種在培養(yǎng)基上，經(jīng)過(guò)幾天以后病原菌就會(huì)在植物體附近大量繁殖，從而造成病原菌污染。初代培養(yǎng)污染一旦產(chǎn)生就會(huì)給實(shí)驗(yàn)造成嚴(yán)重影響，因?yàn)檫@種污染不好控制，清理過(guò)程較為復(fù)雜，所以操作人員要嚴(yán)加防控初代培養(yǎng)污染現(xiàn)象的產(chǎn)生。

3.3 繼代培養(yǎng)污染

繼代培養(yǎng)是指當(dāng)植物組織在培養(yǎng)基里生長(zhǎng)了一段時(shí)間后，培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生枯竭，無(wú)法滿足植物的生長(zhǎng)需求，因此就需要將植物組織轉(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)基上。在植物組織轉(zhuǎn)移的過(guò)程中原本沒(méi)有病原菌污染的植物種苗也容易受到危害，培養(yǎng)基內(nèi)出現(xiàn)的病原菌會(huì)感染到植物種苗上，從而產(chǎn)生污染現(xiàn)象[1]。

4 植物組織培養(yǎng)污染的成因分析

4.1 病原菌的分析

造成植物組織培養(yǎng)污染的主要來(lái)源是病原菌，其中包含細(xì)菌、真菌、酵母菌及防線菌等。細(xì)菌污染通常在接種后1～2d就會(huì)在培養(yǎng)基周圍出現(xiàn)大量粘液狀和發(fā)酵泡沫狀的物體，這種病原菌耐高溫高壓，不易清除。真菌污染是由霉菌引發(fā)的，在培養(yǎng)基上接種5d左右會(huì)出現(xiàn)多種顏色的菌斑。

4.2 外植體的分析

外植體培養(yǎng)是指將植物組織與植物體進(jìn)行分離后，在植物體外進(jìn)行培養(yǎng)工作。外植體的選擇對(duì)植物組織培養(yǎng)有著關(guān)鍵性的作用，因?yàn)橥庵搀w攜帶的病原菌不易清除，會(huì)污染材料內(nèi)部，容易造成培養(yǎng)過(guò)程中的污染。操作人員在取材外植體時(shí)要考慮到氣候等環(huán)境條件，一般植物莖尖處含有的病原菌較少，并且具有生長(zhǎng)速度快、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)，因此選擇莖尖部位可以達(dá)到良好的培養(yǎng)效果。

根據(jù)外植體的取材地點(diǎn)和生長(zhǎng)時(shí)期來(lái)說(shuō)，要避免采集生長(zhǎng)環(huán)境惡劣的植物體，植株越深入地下受到的病菌感染就越小。另外，還要避免采集成年或衰老的植物體，這類植株生長(zhǎng)速度慢，新陳代謝功能差，容易遭受病原菌的感染。因此，在采集外植體時(shí)要進(jìn)行多方面的考慮，盡量選取生長(zhǎng)時(shí)期適合、不易被感染的植株進(jìn)行培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)[2]。

4.3 培養(yǎng)條件的分析

培養(yǎng)室的環(huán)境條件與污染率有著很大的關(guān)聯(lián)，如果培養(yǎng)室的溫度適宜、濕度較大，就會(huì)給病原菌提供有利的生長(zhǎng)條件，從而產(chǎn)生較高的污染概率。植株自身生長(zhǎng)環(huán)境的優(yōu)劣也會(huì)影響組織培養(yǎng)過(guò)程的病菌污染率，操作人員在選取時(shí)要注重其生長(zhǎng)環(huán)境，盡量選取光照充足處的外植體。培養(yǎng)基是繁殖病原菌的主要場(chǎng)所，培養(yǎng)基內(nèi)不宜添加過(guò)多有利于病原菌生長(zhǎng)的有機(jī)成分，且培養(yǎng)基要滅菌到位，合理控制培養(yǎng)基內(nèi)部的溫度、濕度及pH值，為植物組織的健康生長(zhǎng)提供優(yōu)良的環(huán)境條件。

4.4 操作人員的分析

培養(yǎng)過(guò)程中的污染多是來(lái)自于人為因素，操作人員只要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作，就可以有效避免污染現(xiàn)象的產(chǎn)生。人為污染的主要表現(xiàn)有以下幾點(diǎn)：操作人員在進(jìn)行接種工作時(shí)沒(méi)有管理好自身的行為，不及時(shí)清洗、消毒自身的衣物，將細(xì)菌、霉菌帶入無(wú)菌培養(yǎng)室內(nèi)，從而造成污染；工具存放不當(dāng)或滅菌不到位，植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中需要使用大量的工具，如鑷子、器皿、剪子、刀、培養(yǎng)皿等，如果操作人員使用完畢后沒(méi)有及時(shí)清理保存，且使用前未充分滅菌，在下次使用時(shí)就會(huì)對(duì)植株造成污染。

5 植物組織培養(yǎng)污染的防控措施

5.1 選取適宜的外植體

植物組織培養(yǎng)污染防控工作要從外植體采集源頭開始，不同環(huán)境下外植體的帶菌程度不同，選擇適宜的外植體，避免采集帶菌量多的植株，可以有效減少組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染。通常優(yōu)良的外植體一般生長(zhǎng)在光照充足的環(huán)境下，因此夏季是選取外植體的適宜季節(jié)，高溫可以殺死大量的微生物和病菌，能夠最大程度減少外植體本身攜帶的污染。

5.2 外植體滅菌處理

目前，在植物組織培養(yǎng)中普遍使用的滅菌處理方法有抗生素處理法、低溫處理法、減壓滅菌處理法等。其中，抗生素處理法是指當(dāng)植物組織受到嚴(yán)重污染時(shí)采用抗生素進(jìn)行噴灑，可以有效達(dá)到滅菌處理的目的。低溫處理法將培養(yǎng)對(duì)象置于低溫環(huán)境中，使部分病原菌不能存活，不過(guò)此類方法不適用于所有的植物體。減壓滅菌處理的工作原理是通過(guò)減壓操作吸取植物組織中的氣體，使消毒劑進(jìn)入到組織內(nèi)部中，從而達(dá)到滅菌處理的效果[3]。

5.3 培養(yǎng)條件的控制

造成組織培養(yǎng)過(guò)程中產(chǎn)生污染，多數(shù)情況下是操作人員沒(méi)有控制好培養(yǎng)條件。在培養(yǎng)基方面，操作人員要嚴(yán)格進(jìn)行滅菌工作，防止滅菌不徹底造成病原菌繁殖的現(xiàn)象，并且要及時(shí)去除培養(yǎng)基中的有機(jī)成分，有機(jī)成分是提供微生物生存的有利條件，去除有機(jī)成分可以大大減少污染率。另外，在選取培養(yǎng)容器時(shí)要盡量選擇密封性能良好、體積較小的容器，因?yàn)榇祟惾萜骺梢杂行p少污染產(chǎn)生的可能性。

5.4 嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作

操作人員要意識(shí)到標(biāo)準(zhǔn)操作的重要性，嚴(yán)格規(guī)范自身的行為，定期清理消毒衣物和鞋子，避免攜帶病原菌進(jìn)入無(wú)菌接種和培養(yǎng)室內(nèi)。并且要保證工作臺(tái)處于嚴(yán)格的無(wú)菌狀態(tài)，在接種后及時(shí)做好衛(wèi)生工作，可以用新潔爾滅溶液進(jìn)行地面、墻壁和門窗的消毒，尤其要注意容器檢查，避免出現(xiàn)容器密封不嚴(yán)或破損的現(xiàn)象。