基于網絡藥理學研究通心舒膠囊治療冠心病的作用機制

劉甜甜，陳恒文，姚魁武

冠心病是冠狀動脈血氧供應減少或中斷，臨床可見心絞痛、心肌梗死、心肌缺血或猝死的心血管事件[1-2]。冠心病屬中醫“胸痹”“心痛”“心悸”“厥心痛”“真心痛”范疇。中醫學認為胸痹、心痛多因陽氣虧虛、寒邪凝滯、痰濁內蘊、瘀血留停導致血脈瘀滯。通心舒膠囊是臨床治療冠心病心絞痛的常用藥，由川芎、丹參提取物及沙棘提取物組成，方中川芎和丹參能活血化瘀、行氣止痛；沙棘健脾養胃、活血散瘀；全方共奏益氣活血、散瘀止痛之功效。通心舒膠囊對氣虛血瘀型冠心病具有明顯療效。目前關于通心舒膠囊對冠心病療效的作用機制尚未見報道。本研究旨在借助網絡藥理學方法探討通心舒膠囊治療冠心病的分子機制，為臨床用藥提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 通心舒膠囊活性成分及其作用靶點篩選 采用中藥系統藥理學數據庫分析平臺(TCMSP)搜索通心舒膠囊(川芎、丹參、沙棘)活性成分，依據口服生物利用度(DB)>30%且類藥性(DL)>0.18篩選通心舒膠囊中的有效成分，并檢索其作用靶點，借助Uniprot數據庫和STRING數據庫找到靶點蛋白相應的基因名稱。

1.2 通心舒膠囊-靶點網絡構建 將篩選出的化合物和靶點基因輸入Cytoscape 3.7.2軟件構建通心舒膠囊化合物-靶點網絡[3]，并對網絡進行拓撲結構分析。網絡中的“節點”代表通心舒膠囊活性成分和靶基因，“邊”表示通心舒膠囊活性成分與靶基因之間的關系。

1.3 通心舒膠囊-疾病靶基因蛋白相互作用(PPI)網絡構建 使用DisGeNET數據庫，輸入關鍵詞“冠心病”，檢索冠心病相關靶基因。利用Venny 2.1.0軟件繪制通心舒膠囊活性成分與冠心病相交靶標的韋恩圖。將篩選得到的作用靶基因錄入STRING 11.0數據庫平臺，得到的數據以TSV.格式導入Cytoscape 3.7.2軟件，構建通心舒膠囊活性成分與冠心病靶基因PPI網絡，并對PPI網絡進行拓撲結構分析，選擇自由度(degree)和介數中心性(betweenness centrality)都大于平均值的靶點為關鍵靶點。

1.4 基因富集分析 應用DAVID 6.8數據庫對通心舒膠囊活性成分與冠心病PPI網絡中的關鍵靶點進行基因本體(gene ontology，GO)功能分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析，依據錯誤發現率Benjamini<0.05篩選具有顯著性差異的生物過程、分子功能及KEGG通路，繪制信號通路高級氣泡圖。

2 結 果

2.1 通心舒膠囊活性化合物 依據OB、DL及活性成分含量，排除重復化合物和沒有作用靶點的成分，篩選出通心舒膠囊有效化合物88個，其中川芎7個，丹參59個，沙棘22個，獲得相應作用靶點253個，通心舒膠囊活性成分基本信息見表1。

表1 通心舒膠囊主要活性化合物

(續表)

(續表)

2.2 通心舒膠囊活性成分-靶點網絡 利用Cytoscape 3.7.2軟件將通心舒膠囊中川芎、丹參、沙棘活性物質分別與作用靶點構建化合物-靶點網絡，川芎化合物-靶點網絡中有41個節點和92條邊，degree值最高的前4個化合物是楊梅酮、川芎哚、川芎萘呋內酯、川芎嗪。詳見圖1。丹參化合物-靶點網絡中有196個節點和1 864條邊，degree值最高的前21個化合物包括木犀草素、1，2，5，6-四氫丹參酮、去氫龍膽素ⅡA、2-異丙基-8-甲基菲-3，4-二酮、4-亞甲丹參新酮、亞甲基丹參醌、吡喹酮c、隱丹參酮、丹參新醌D、丹參螺縮酮內脂、脫氧隱丹參酮、二氫丹參內酯、表丹參螺縮酮內脂、異隱丹參酮、異丹參酮Ⅱ、丹參醌酚Ⅰ、丹參新酮、新隱丹參酮Ⅱ、1-甲基-8，9-二氫-7H-萘[5，6-g]苯并呋喃-6，10，11-三酮、丹參酮、丹參酮ⅡA。詳見圖2。沙棘化合物-靶點網絡中有243個節點和1014條邊，degree值最高的前12個化合物依次為槲皮素、異鼠李素、β-谷甾醇、山奈酚、豆甾醇、兒茶素、天竺葵素、β-胡蘿卜素、5，7-二羥基-2-(3-羥基-4-甲氧基苯基)鉻-4-酮、黃酮、黃酮醇、(2S)-黃烷酮。詳見圖3。以上37個degree值較高的化合物可能是通心舒膠囊治療冠心病的關鍵活性成分。

圖1 川芎化合物-靶點網絡

圖2 丹參化合物-靶點網絡

圖3 沙棘化合物-靶點網絡

2.3 通心舒膠囊與冠心病靶基因的PPI網絡分析 將253個通心舒膠囊活性成分作用靶點與912個冠心病靶點錄入在線Venny 2.1.0軟件繪制韋恩圖(見圖4)，兩者取交集后獲得通心舒膠囊活性成分-冠心病作用靶點90個，將這90個靶基因錄入STRING數據庫，得到蛋白基因互作信息，然后導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化及網絡拓撲學分析，得到通心舒膠囊對冠心病作用靶點基因PPI網絡(見圖5)，網絡包括81個節點、466條邊。由網絡拓撲學分析可知，網絡集聚系數為0.359，網絡中心性為0.183，網絡密度為0.072，網絡異質性為0.759，最短路徑為6 164(95%)。節點自由度值和介數中心性是描述網絡節點的重要指標。圖5中平均節點的degree值為5.753，平均介數中心性為0.025，大于平均degree值的節點有33個，圖中黃色橢圓形節點表示大于平均degree值的蛋白基因。節點大于平均介數中心性的節點有26個，依據網絡節點的degree值和介數中心性篩選出18個核心作用靶點，分別為視黃醇X受體α(RXRA)、蛋白激酶B1(AKT1)、血管內皮生長因子A(VEGFA)、白細胞介素-6(IL6)、原癌基因c-Fos(FOS)、表皮生長因子受體(EGFR)、腫瘤抑制因子P53(TP53)、趨化因子8(CXCL8)、內皮素1(EDN1)、前列環素內環氧化物合成酶2(PTGS2)、白蛋白(ALB)、整合素B3(ITGB3)、白細胞介素-4(IL4)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、絲氨酸蛋白酶抑制蛋白E1(SERPINE1)、基質金屬蛋白酶-9(MMP9)、糖皮質激素受體基因(NR3C1)、細胞間黏附分子1(ICAM1)。這些核心靶點在PPI網絡中起著關鍵作用，可能是通心舒膠囊治療冠心病的潛在靶點。

圖4 通心舒膠囊與冠心病交叉靶基因韋恩圖

圖5 通心舒膠囊-冠心病PPI網絡

2.4 GO生物功能和KEGG通路富集分析 通過DAVID數據庫分析出通心舒膠囊治療冠心病的生物過程438個，分子功能83個。依據錯誤發現率Benjamini<0.05篩選出158個生物過程和38個分子功能。對生物過程中富集基因數≥10的前25項作圖，涉及的主要生物過程包括調節RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄、凋亡過程、炎癥反應、缺氧反應、血管新生、調節一氧化氮生物合成等。詳見圖6。參與的分子功能主要有蛋白酶結合、鋅離子結合、細胞因子活性、轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性、蛋白激酶結合、生長因子活性等。詳見圖7。對KEGG通路富集分析，依據Benjamini<0.05及排除廣泛共性通路后，篩選出通心舒膠囊治療冠心病相關的信號通路20個，繪制氣泡圖。詳見圖8。

圖6 通心舒膠囊-冠心病生物過程

圖7 通心舒膠囊-冠心病分子功能

圖8 通心舒膠囊-冠心病交叉基因的信號通路

3 討 論

本研究基于網絡藥理學方法，采用高通量數據庫平臺及Cytoscape軟件，構建通心舒膠囊與冠心病PPI網絡，并對靶點進行生物功能和信號通路富集分析，比較系統地探討通心舒膠囊治療冠心病的作用機制。結果顯示，通心舒膠囊治療冠心病的關鍵化合物有川芎嗪、木犀草素、丹參酮、異丹參酮、槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、β-胡蘿卜素、黃酮、黃酮醇等。研究證實川芎嗪、丹參酮、槲皮素、沙棘黃酮等均有改善心肌缺血的功效[4-7]。說明通心舒膠囊治療冠心病是多種活性成分共同作用的結果。信號通路富集結果提示通心舒膠囊通過作用于多條信號通路治療冠心病，并且這些通路多數被證實與冠心病的發病機制密切相關。研究發現，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)-絲蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、叉頭框O(FoxO)、核因子-κB(NF-κB)、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、Janus激酶(JAK)/信號轉導和轉錄激活因子(STAT)等信號通路都參與缺血心肌損傷及凋亡過程[8-14]。本研究表明通心舒膠囊通過作用于腫瘤壞死因子(TNF)和NF-κB信號通路，抑制炎癥反應，減輕氧化損傷；通過活化鈣信號通路，提升胞內鈣離子濃度；通過激活血管內皮生長因子(VEGF)、轉化生長因子-β(TGF-β)、PI3K/AKT通路，保護血管內皮，促進血管新生；以及通過作用于絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和mTOR信號通路，抑制心肌凋亡，從而改善心肌缺血狀態，促進心功能恢復，達到治療冠心病目的。

本研究基于網絡藥理學進一步闡明了通心舒膠囊的作用機制，為后續的實驗研究和臨床用藥指明了方向。由于網絡藥理學是建立在復雜的網絡模型上，雖然能解釋中藥復方多成分、多靶點、多通路的關系，但是網絡統計的一些小分子化合物及作用靶點信息存在一定的局限性、篩選活性成分的標準不統一，因此，其結果的準確性還需實驗進一步驗證。