基于網絡藥理學和分子對接探討漏蘆防治缺血性腦卒中的作用機制

李媛媛，劉珂依，宋 珂，劉浩琦，安 娜，王麗琴，張涵萊，孫逸坤，朱陵群，邢雁偉，高 穎，高永紅

腦卒中又稱“中風”，是全球范圍內最主要的威脅人類生命健康的疾病之一，具有高發病率、高致殘率和高死亡率的臨床特點[1]。缺血性腦卒中是中風最常見的一種疾病類型，約占中風病人總數的87%，主要是由于局部供血障礙導致大腦缺氧性病變和缺血性壞死，進而引發局灶或完全性神經功能缺損[2-3]。目前缺血性腦卒中最有效的治療策略是溶栓療法，但由于受時間窗限制且存在出血性轉化等影響，臨床使用率相對較低[4-5]。因此，如何預防缺血性腦卒中的發生發展，改善腦卒中病人的預后及生活質量，已成為目前臨床關注的熱點之一。漏蘆為菊科植物祁州漏蘆的干燥根，主要分布于我國華北、東北和西北諸省，具有清熱解毒、消癰下乳、祛瘀通脈之功效[6]。早在《神農本草經》中就有關于漏蘆的記載，“漏蘆，味苦咸寒，久服輕身益氣，耳目聰明，不老延年，列為上品”[7]?，F代研究發現，漏蘆具有抗氧化、抗缺氧、抗炎、抗動脈粥樣硬化以及改善記憶障礙等作用[8]，可通過抑制炎癥反應，清除氧自由基以及興奮性氨基酸等毒性物質，發揮防治缺血性腦卒中的作用[9]。但漏蘆防治缺血性腦卒中具體作用機制尚不清楚，本研究基于網絡藥理學構建“藥物-有效成分-潛在靶點-通路-疾病”的一種復雜網絡調控圖，進一步闡釋漏蘆防治缺血性腦卒中的生物學機制，并利用分子對接技術驗證漏蘆有效活性成分與其靶點蛋白的親和性，為深入探討漏蘆防治缺血性腦卒中的分子作用機制提供了一定的研究基礎和理論依據。

1 材料與方法

1.1 數據庫和軟件 本研究涉及的數據庫有TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)，ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/)，Swiss Target Prediction(http://swisstargetprediction.ch/)，SymMap(https://www.symmap.org/)，CTD(http://ctdbase.org/)，Uniprot(https://www.uniprot.org/)，DisGeNET(https://www.disgenet.org/)，TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)，Drugbank(https://www.drugbank.ca/)，String(https://string-db.org/cgi/input.pl)，Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)，PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)，RCSB PDB(https://www.rcsb.org)；軟件有Cytoscape 3.8.0、Auto DockTools 1.5.6、PyMOL 2.4.0、Discovery Studio 4.0、OpenBabel 2.4.1。

1.2 漏蘆活性成分的篩查 應用TCMSP數據庫，以“漏蘆”為檢索詞，并根據藥動力學原理，依據“口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18”獲取漏蘆有效活性成分。

1.3 有效活性成分作用靶點和疾病潛在靶點的獲取及收集 通過TCMSP、ETCM、Swiss Target Prediction、SymMap、CTD等數據庫獲取漏蘆有效活性成分的作用靶點，經過整理、校對、去重后，收集漏蘆有效成分相關的靶蛋白信息。然后利用Uniprot數據庫將收集到的蛋白靶點標準化，篩選出物種條件為人的靶點，即為漏蘆有效成分的潛在靶點。 以“ischemic stroke”為檢索詞，在DisGeNET、TTD、Drugbank數據庫中檢索缺血性腦卒中相關的靶點蛋白，獲得疾病潛在作用靶點。將漏蘆有效成分的潛在靶點與缺血性腦卒中相關靶點進行交集，篩選出二者共同靶點，這些共同的靶標蛋白很可能作為漏蘆防治缺血性腦卒中的相關候選靶點。

1.4 藥物-主要成分-疾病-靶點網絡的構建 將上述獲得的漏蘆有效成分治療缺血性腦卒中的潛在靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件中，構建“藥物-成分-疾病-靶點”的調控網絡圖，其中外側節點顯示的是漏蘆活性成分治療缺血性腦卒中的潛在作用靶點，網絡中心節點代表的是漏蘆及其主要活性成分。整個網絡圖直觀地顯示了漏蘆-有效成分-缺血性腦卒中-潛在靶點之間的關系。

1.5 蛋白相互作用(PPI)網絡的構建與分析 將上述共同靶點導入String數據庫中，設置物種為人，獲得蛋白-蛋白之間的相互作用關系，保存其為TSV格式，然后將得到的數據導入Cytoscape 3.8.0軟件中，構建PPI網絡；同時利用“Network Analyzer”插件進行網絡拓撲參數分析，并選取自由度值(degree)、介數(betweenness)和中心度(closeness)均大于中位數的節點，確定為漏蘆防治缺血性腦卒中的關鍵靶點。

1.6 關鍵靶點的富集分析和可視化 運用DAVID數據庫將上述得到的關鍵靶點進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析，以P<0.05為標準，富集結果分別采用柱狀圖和氣泡圖的形式進行展示。

1.7 漏蘆活性成分與作用靶點的分子對接驗證 利用AutoDock軟件構建漏蘆活性成分與PPI網絡圖中degree排名前5位的蛋白靶點的分子對接模型，從而驗證網絡分析結果的可靠性。從PubChem數據庫中下載漏蘆活性成分3D結構的“SDF”格式文件，導入OpenBabel 2.4.1進行優化；再通過RCSB PDB數據庫篩選對應蛋白靶點的最佳蛋白晶體結構的“PDB”格式文件。對漏蘆活性成分和重要靶點蛋白的3D結構進行去水、加氫等處理后，將其轉換成pdbqt格式，最后利用AutoDock軟件進行分子對接，結合能越大表明配體與靶點之間的結合越好。

2 結 果

2.1 漏蘆活性成分的篩選 在TCMSP數據庫中以“漏蘆”為檢索詞，獲得漏蘆活性成分25個，進一步以“OB≥30%，DL≥0.18”為篩選閾值，共獲得5種漏蘆的有效活性成分。詳見表1。

表1 漏蘆的有效活性成分及其參數

2.2 漏蘆防治缺血性腦卒中的潛在作用靶點 通過TCMSP、ETCM、SWISS、SymMap和CTD數據庫預測漏蘆有效成分相關靶點，去重整理后共獲得相關靶標375個。利用DisGeNET、TTD和Drugbank數據庫平臺合并去重后挖掘得到缺血性腦卒中相關基因1 206個。分別將漏蘆潛在靶點與缺血性腦卒中相關基因輸入Venny 2.1.0中，繪制韋恩圖，獲得漏蘆防治缺血性

腦卒中相關候選靶點118個。詳見圖1。

圖1 漏蘆-缺血性腦卒中靶點韋恩圖

2.3 藥物-活性成分-疾病-靶點調控網絡構建結果 應用Cytoscape軟件繪制藥物-活性成分-疾病-靶點復雜網絡調控圖，其中青色代表缺血性腦卒中(CIS)，黃色代表漏蘆，紫色代表漏蘆的有效活性成分，紅色代表漏蘆-缺血性腦卒中的共同靶點。結果表明，漏蘆主要通過5種有效活性成分作用于118個靶點，其可能作為漏蘆防治缺血性腦卒中的重要潛在靶標。詳見圖2。

圖2 中藥-成分-疾病-靶點調控網絡

2.4 PPI網絡構建及關鍵靶點篩選 將上述漏蘆防治缺血性腦卒中的118個候選靶點導入String數據庫中，限定物種為人，得到蛋白之間相互作用關系，保存為TSV格式文件，并將其導入Cytoscape軟件中構建PPI網絡圖。詳見圖3。圖中的節點表示蛋白，邊表示蛋白與蛋白之間的相互關系，共涉及111個節點、1 165條邊(其中MIR122、MIR132、MIR192、MIR223、MIR34A、MIR363未在數據庫中找到，PDE3A與其他蛋白不存在相互作用關系，故均未在網絡中體現)。其中節點的大小和顏色與degree值成正比，節點越大對應degree值越大，顏色由藍變紅對應的degree值亦逐漸增大。利用Cytoscape中“Network Analyzer”功能從網絡節點重要性的角度進行網絡拓撲參數分析，獲得度值、介數和中心度等網絡拓撲特征值。以中位數為卡值，篩選3項均滿足卡值的靶點為漏蘆防治缺血性腦卒中的關鍵靶點，共獲得關鍵靶點44個。詳見表2。

圖3 中藥-疾病蛋白相互作用網絡

表2 漏蘆防治缺血性腦卒中關鍵候選靶點

2.5 關鍵靶點的富集分析及可視化 運用DAVID數據庫對上述關鍵靶點進行GO富集分析，按照顯著度P<0.05共確定了272個條目。其中細胞生物過程富集的基因數相對較多，共207個條目，排名比較靠前的有一氧化氮生物合成過程的正向調控、藥物的反應、細胞對脂多糖的反應、基因表達的正調控、凋亡的負向調節、轉錄調控及衰老過程等，表明漏蘆可能主要通過調節以上多條生物過程發揮治療缺血性腦卒中的作用。與細胞組成相關的條目共30個，富集結果主要集中在細胞外間隙、細胞質、細胞質膜、高爾基體、溶酶體等。涉及分子功能的靶點條目共35個，主要包括酶結合、蛋白結合、類固醇激素受體活性、血紅素結合、轉錄因子結合等。根據Count值排序，分別取前10名進行分析。詳見圖4。通過DAVID數據庫對漏蘆防治缺血性腦卒中相關的44個關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，根據P<0.05篩選獲得76條相關信號通路，經查文獻發現與缺血性腦卒中密切相關的信號通路有3條，分別是腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、低氧誘導因子-1(HIF-1)信號通路、Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路。根據P值從小到大排序選取前20條信號通路進行可視化處理(富集程度可根據P值和基因個數進行衡量)。詳見圖5。

圖4 漏蘆防治缺血性腦卒中關鍵靶點的GO富集分析

圖5 漏蘆關鍵靶點KEGG富集通路氣泡圖

2.6 藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡的構建 將上述所得到的漏蘆及其有效活性成分、關鍵靶點、信號通路和缺血性腦卒中同時導入Cytoscape軟件中進行可視化處理，構建藥物-成分-靶點-通路-疾病網絡結構圖(見圖6)。其中紅色節點代表漏蘆，紫色節點代表漏蘆有效活性成分，青色節點代表漏蘆防治缺血性腦卒中潛在的關鍵靶點，粉色節點代表靶點相關KEGG通路，黃色節點代表缺血性腦卒中。由圖6可知，漏蘆可通過5種不同的活性成分作用于不同的靶點，包括白蛋白(ALB)、白細胞介素-6(IL-6)、TNF、半胱氨酸蛋白酶-3(CASP3)及絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)等；此外不同的靶點亦可通過多條通路發揮抗缺血性腦卒中的作用機制，涉及TNF信號通路、HIF-1信號通路、TLR信號通路等。該網絡圖充分體現了中藥漏蘆具有多成分、多靶點、多途徑發揮防治缺血性腦卒中的臨床特征，作用機制復雜多樣。

圖6 漏蘆-成分-靶點-通路-疾病多維網絡圖

2.7 漏蘆主要活性成分與對應核心靶點蛋白的分子對接驗證 利用AutoDock軟件將甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷等5種化合物與ALB、IL-6、TNF、CASP3及MAPK1等相對應的核心靶點分別建立分子對接模型(見圖7)。對接結果只保留每對分子對接Affinity(kcal/mol)絕對值最高的。一般認為，結合能大于5 kcal/mol表明化合物與靶點蛋白之間結合活性較好；結合能大于7.0 kcal/mol表明小分子與受體蛋白具有很強的結合活性。熱圖結果顯示，除了甘草素與MAPK1的對接打分小于7.0 kcal/mol之外，其他化合物與對應靶點的結合能均大于7.0 kcal/mol，說明漏蘆有效活性成分與ALB、IL-6、TNF、CASP3及MAPK1共5種核心靶點之間具有較好的結合活性。綜合上述結果，表明甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷和黃獨素B與潛在核心靶點具有較好的結合活性，表明漏蘆可能通過作用于潛在核心靶點發揮防治缺血性腦卒中的作用。同時借助Pymol 2.4.0軟件分別對β-谷甾醇與ALB、β-谷甾醇與IL-6、黃獨素B與ALB以及黃獨素B與IL-6進行分子對接可視化。詳見圖8。

圖7 分子對接分數的熱圖分析

圖8 分子對接模式圖

3 討 論

缺血性腦卒中是以偏癱、失語等局灶性神經功能缺損為特征的一種疾病，發病迅速、病情復雜、變化多端且預后相對較差。其中瘀血作為缺血性腦卒中的主要病理產物和致病因素，貫穿疾病的始終，成為疾病發生發展的關鍵因素之一[10]。漏蘆，性寒，味苦微咸，入胃及大腸經，為解毒通絡之良藥。臨床研究發現，漏蘆可配伍不同藥味共奏活血通絡，清除腦中瘀毒之功，如腦栓通膠囊、復方蓯蓉益智膠囊等中成藥[11-12]。雖然漏蘆可以改善缺血后腦損傷反應，但是其作用機制尚不明確。本研究借助網絡藥理學方法為漏蘆防治缺血性腦卒中的分子機制研究提供了參考。

本研究以TCMSP數據庫中OB、DL為參數，共獲得5種漏蘆的有效活性成分，分別是甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷和黃獨素B。藥理研究表明，甘草素具有抗氧化、抗炎和抗病毒等多種生物活性，可顯著上調雌激素受體β基因(ERβ)的表達而發揮抗炎效應，抑制NOD樣受體家族3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶 -1(Caspase-1)、白細胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的釋放，減輕神經炎癥反應[13-14]。β-谷甾醇具有血管生成的作用，可以有效恢復缺血/再灌注損傷沙鼠的運動功能[15]。甘草苷作為小鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷的潛在治療藥物，其可能是通過抗氧化以及抗凋亡的藥理特性發揮缺血后的神經保護作用。上述已有文獻報道為本實驗結果提供了一定的理論基礎，即甘草素、β-谷甾醇和甘草苷可作為漏蘆防治缺血性腦卒中的關鍵有效活性成分。此外，文獻中關于谷甾醇和黃獨素B在腦缺血方面的研究相對較少，可作為以后實驗研究的新視角。

通過中藥-成分-靶點-疾病網絡圖和PPI網絡分析表明，ALB、IL-6、TNF、CASP3及MAPK1等可能是漏蘆防治缺血性腦卒中的核心靶點。其中ALB是血液系統中的重要組成成分，在抑制血小板聚集、調節血管滲透性及抗凝血功能等方面發揮著重要的生理功能[16]。此外，ALB具有抗炎和神經保護功能，在人體的免疫系統中亦發揮著十分重要的作用[17-18]，其可能與腦卒中的預后關系較為密切。炎癥是缺血性腦卒中的病理標志，TNF、IL-6作為強有力的炎性細胞因子，是未來中風治療的潛在靶點。最近有研究表明，卒中后IL-6的釋放可通過激活N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體以及內皮素-1(ET-1)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的上調導致腦卒中后腦脊液和腦組織釋放，進而損害腦血管的自動調節并促進海馬神經壞死[19]。TNF是通過激活單核細胞或巨噬細胞產生的炎性因子[20]，可以通過激活膠質細胞并介導血管內皮細胞上黏附分子的表達，從而促進中性粒細胞的浸潤，在缺血性腦卒中的發病機制中起著至關重要的作用[21]。CASP3作為Caspase家族中備受關注的蛋白之一，可催化多種細胞關鍵蛋白的特異性斷裂，是細胞凋亡過程中最關鍵的凋亡執行蛋白酶[22]，在啟動缺血腦區受損神經元凋亡的關鍵環節中發揮著十分重要的作用[23-25]。目前，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號傳導已被廣泛研究，在缺血性腦中后調節細胞凋亡和炎性細胞因子的表達中起著關鍵作用[26]。MAPK1作為生化信號的整合點，在多種細胞生物過程，包括細胞增殖、分化、轉錄、調控和發育等方面均發揮著至關重要的調控作用[27]。

KEGG富集通路結果表明，漏蘆的關鍵靶點主要富集于以下幾條相關通路，包括TNF信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路等途徑。其中TNF信號通路是參與中風后炎癥反應及血腦屏障破壞的重要信號通路之一[28-30]。腦缺血發生后，缺血神經元會釋放大量炎性細胞因子(IL-6、TNF-α等)，從而誘發更多的炎性細胞因子及細胞毒素物質的產生，進一步破壞血腦屏障和細胞外基質，加速繼發性腦損傷的發生[31]。HIF-1信號通路是缺血后促進血管再生以及維持血腦屏障完整性的關鍵通路之一，其中低氧誘導因子-1α(HIF-1α)作為血管內皮生長因子的上游調節劑，是腦損傷應答的重要轉錄因子，參與調節血管的生成、細胞的凋亡與自噬等多條信號通路[32-33]。此外，TLR信號通路在腦缺血引起的神經損傷過程中也起著重要的作用。輕度缺血性腦損傷可通過抑制Toll樣受體4(TLR4)/核因子-κB(NF-κB)和Toll樣受體2(TLR2)信號通路以及激活干擾素調節因子3(IRF3)信號通路從而導致TLR缺血耐受并減少腦損傷；反之，急性缺血性腦卒中亦可激活TLR信號通路，進一步誘導炎性介質的釋放，并引發繼發性炎癥反應的發生。因此，推測漏蘆有效成分可能是通過TNF信號通路、HIF-1信號通路、TLR信號通路等途徑調控ALB、IL-6、TNF、CASP3、MAPK1等核心靶點防治缺血性腦卒中。分子對接結果亦表明，甘草素、β-谷甾醇、谷甾醇、甘草苷和黃獨素B與ALB、IL-6、TNF、CASP3、MAPK1等相對應靶點結合能均大于7 kcal/mol，提示兩者之間均具有較強的結合活性，提示其很有可能是防治缺血性腦卒中的關鍵活性成分及核心靶點。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法預測漏蘆防治缺血性腦卒中的分子機制，結果表明，漏蘆有效活性成分可能通過TNF信號通路，HIF-1信號通路，TLR信號通路等途徑調控ALB、IL-6、TNF、CASP3、MAPK1等核心靶點防治缺血性腦卒中；同時采用分子對接技術證實了漏蘆有效活性成分與其相關靶點均能夠最佳結合，提示漏蘆通過“多成分-多靶點-多途徑”的方式防治缺血性腦卒中，發揮抑制炎癥反應、抗氧化、調節免疫、促進血管新生和神經功能恢復等效應。然而本研究僅在理論水平上初步預測了漏蘆防治缺血性腦卒中的分子機制，旨在為深入挖掘漏蘆-靶點-通路之間的相互關系提供新思路，為進一步開展相關實驗研究提供一定的理論基礎。