養心定悸膠囊預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用

汪雁博，郝國貞，姜云發，支 偉，刁敬超，王 慶

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是目前我國致死率及致殘率最高的主要疾病之一，其發病率呈逐年上升趨勢[1]。AMI治療的關鍵是迅速開通梗死相關動脈，盡早恢復心肌組織血流灌注[2]。缺血再灌注損傷是AMI再灌注治療中的常見并發癥，其治療策略仍有待進一步探索[3]。養心定悸膠囊來源于《傷寒論》中治療“心動悸、脈結代”的經典名方炙甘草湯，由炙甘草、桂枝、地黃、麥冬、紅參、芝麻、生姜、大棗、阿膠9味藥材組成，具有益氣養血、滋陰復脈的功效。其組方中的主要成分具有抗血栓、抗炎、抗心律失常、保護心肌細胞的作用，可有效改善心肌細胞炎癥反應，調節心肌酶活性，減少心肌缺血再灌注損傷[4-5]，但是養心定悸膠囊對心肌缺血再灌注損傷的作用尚不明確。本研究旨在探討養心定悸膠囊預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用，為優化AMI再灌注治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 6～8周齡的健康雄性SD大鼠36只，體質量250～280 g，由河北醫科大學動物中心提供，溫度(22±1)℃，濕度45%～55%，自由進食、飲水。適應性喂養1周后建立模型。

1.2 藥品和儀器

1.2.1 藥品 養心定悸膠囊(石藥集團河北永豐藥業有限公司生產，每粒0.5 g)，配制成溶液，灌胃使用。

1.2.2 主要儀器 超純水系統(星號：NW10LVF，香港Heal Force)、-70 ℃超低溫冰箱(型號：DW HL-668，安徽中科美菱生產)、微量移液器(型號：Proline，蘇州BIOHIT生產)、酶標儀(型號：ELX-800，美國BIOTEK生產)、紫外可見分光光度計(型號：Proline，蘇州BIOHIT生產)、數顯恒溫水浴鍋(型號：HH-4金壇，榮華儀器)、電熱恒溫培養箱(型號：DH36001B，天津泰斯特)。

1.2.3 主要試劑 生理鹽水(貨號：1705020511，中國都邦藥業)、磷酸緩沖鹽溶液(PBS，貨號：P10033，中國雙螺旋)、氯化三苯基四氮唑(2，3，5-tripheny ltetrazolium chloride，TTC，貨號：T109275，中國阿拉丁)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：WLA004，中國萬類生物)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)測試盒(貨號：E006，中國南京建成)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒(貨號：WLE05，中國萬類生物)、白細胞介素-6(IL-6)ELISA檢測試劑盒(貨號：WLE04，中國萬類生物)、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒(貨號：WLA072，中國萬類生物)、丙二醛(MDA)試劑盒(貨號：WLA048，中國萬類生物)、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒(貨號：WLA110，中國萬類生物)。

1.3 分組和模型制備 將大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組和養心定悸組，每組12只。

1.3.1 養心定悸組 用0.1 mg/g的養心定悸溶液進行灌胃給藥，每日3次，連續7 d。隨后給予大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠固定于手術臺上，仰臥位，頸部去毛消毒，手術剪剪開皮膚暴露氣管，連接至呼吸機行機械通氣，設置呼吸頻率80次/min，潮氣量6～8 mL/kg，呼吸比為2∶1，根據具體呼吸頻率及深度適當調整呼吸參數。左前胸去毛消毒，順肋間隙方向，胸骨左側切開皮膚1.0～1.5 cm，分離皮下組織和肌肉，入胸后推開胸腺，暴露心臟及大血管根部。剪開心包，在左心耳下緣與肺動脈間可見左冠狀動脈前降支起始部，在距離主動脈根部3～5 mm處，以左冠狀靜脈為標志，用尼龍縫線結扎造成缺血，縫合皮膚，計時器計時45 min。打開尼龍縫線，使血液流通，復灌3 h。結束再灌注3 h后，同步處死大鼠，收集心肌組織及頸靜脈血(分離血清)，進行后續實驗。

1.3.2 模型組 給予大鼠同養心定悸組相同體積的生理鹽水進行灌胃處理，每日3次，連續7 d，手術操作同養心定悸組。

1.3.3 假手術組 大鼠縫線不結扎，其他操作與模型組相同。

1.4 組織病理學觀察 結束再灌注3 h后，從右頸動脈注入1% Evans blue 3 mL/kg，區分缺血區和非缺血區心肌。隨即取下整個心臟，以PBS沖洗，剪去心房，心室部分垂直于長軸橫切成4～6塊1～2 mm厚的心肌片，置于1% TTC溶液，37 ℃孵育12 min，將活的心肌組織染成磚紅色。經 TTC染色的心肌厚片固定于10%緩沖中性甲醛溶液24 h，用濾紙吸干后稱重。雙面彩色掃描，圖像輸入電腦保存。掃描后的心肌片保存在甲醛濾液內，隨后石蠟包埋。非缺血區已由苔酚藍染成藍色，缺血危險區內包括磚紅色的存活心肌及未被染色的灰白梗死組織。根據心肌厚片表面的3種顏色，用電腦圖像分析軟件(Photoshop 7.0和計算不規則多邊形面積軟件2.0.4)分別測定雙面梗死區面積和缺血區面積占整片心肌切面的百分比。

1.5 心肌損傷標志物和血清標志物測定 準確稱取心肌組織重量，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍的生理鹽水，冰浴條件下機械勻漿，2 500 r/min離心10 min，制備成10%的勻漿上清液。采用BCA法測定CK-MB和LDH蛋白含量。ELISA測定血清TNF-α、IL-6、超氧化物歧化酶(SOD)和MDA水平。

2 結 果

2.1 各組大鼠心肌梗死面積比較 各組大鼠周齡及體質量比較差異均無統計學意義(P>0.05)。各組大鼠依照分組進行處理后，迅速取下心臟，進行TTC染色后，大鼠梗死區心肌呈現白色，非梗死區為暗紅色；假手術組大鼠心肌均呈現暗紅色，無白色梗死區域出現。詳見圖1。與假手術組相比，模型組和養心定悸組大鼠心肌梗死面積明顯增加(P<0.05)，養心定悸組心肌梗死面積較模型組明顯減小(P<0.05)。詳見表1。

圖1 3組大鼠心肌梗死面積比較

表1 3組心肌梗死面積比較 單位：%

2.2 3組心肌損傷標志物比較 與假手術組比較，模型組與養心定悸組血清CK-MB、LDH水平均明顯增高(P<0.05)；養心定悸組血清CK-MB、LDH水平較模型組明顯降低(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組心肌損傷標志物水平比較(±s)

2.3 3組血清標志物水平比較 模型組與養心定悸組TNF-α、IL-6、MDA水平較假手術組明顯升高(P<0.05)；養心定悸組TNF-α、IL-6、MDA水平明顯低于模型組(P<0.05)。模型組與養心定悸組SOD水平較假手術組明顯降低(P<0.05)，養心定悸組SOD水平高于模型組(P<0.05)。詳見表3。

表3 3組血清標志物水平比較(±s)

3 討 論

有研究顯示，10%～30%的AMI病人即使開通梗死相關血管后，也未能恢復有效的心肌灌注[6]，即存在著心肌失灌注性微循環障礙和再灌注損傷性微循環障礙的病理生理過程，兩者因果互動，導致心肌損傷惡化加重，即缺血再灌注損傷[7]。很多基礎和臨床研究致力于探討AMI后缺血再灌注損傷的防治策略[8]，但是目前尚缺乏確切方案。

SD大鼠基因組與人類相似，其冠狀動脈側支循環少，冠狀動脈結扎模型穩定性好，是制備缺血再灌注模型的經典動物，已經被廣泛應用于AMI缺血再灌注損傷的相關研究中[9]。本實驗選用雄性SD大鼠前降支結扎缺血再灌注模型，探討養心定悸膠囊預處理對缺血再灌注損傷的防治作用。養心定悸膠囊收載于《中國藥典》2015版和《新藥轉正標準》中，其處方來源于《傷寒論》中治療“心動悸、脈結代”的經典名方炙甘草湯，由炙甘草、桂枝、地黃、麥冬、紅參、芝麻、生姜、大棗、阿膠9味藥材組成，具有益氣養血、滋陰復脈的功效，被廣泛應用于心律失常的治療。方中桂枝味辛溫，善溫經、通脈、通陽化氣；甘草味甘平，能益氣復脈，兩者配伍，為臨床“辛甘化陽”的經典藥對。其中，甘草中甘草酸類成分甘草酸和黃酮類成分甘草普具有抗血栓、抗炎、抗心律失常、心肌細胞保護作用，可有效改善心肌細胞炎癥反應，調節心肌酶活性，減少心肌缺血再灌注損傷，而桂枝中的主要活性成分桂皮酸和桂皮醛具有降壓、解熱、鎮痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗血小板聚集、抗凝血等多種藥理作用[10-11]。

本研究結果發現應用養心定悸膠囊預處理后大鼠心肌梗死面積減少，提示養心定悸膠囊預處理對減輕心肌缺血再灌注損傷后的心肌梗死面積具有一定的保護作用。

氧自由基的產生及其介導的脂質過氧化是缺血再灌注損傷的重要環節之一，可直接對細胞膜產生損傷作用，增加LDH和CK-MB釋放，促使心肌壞死。心肌缺血產生大量氧自由基，作用于細胞膜上的不飽和脂肪酸，形成氧自由基脂質過氧化的最后產物MDA[12]。因此，MDA可以反映心肌損傷的程度。SOD可清除氧自由基，對抗MDA的損害作用，是心肌內重要的抗氧化酶[13]，具有減輕缺血/再灌注損傷的作用[14]。TNF-α和IL-6是已知的與心肌缺血再灌注損傷有著密切聯系的炎性因子[15]，隨著再灌注時間的延長，血清TNF-α呈上升趨勢[16]，尤其在AMI發生時，TNF-α水平明顯升高，TNF-α會誘導大量中性粒細胞黏附心肌細胞，釋放毒性物質損害心肌細胞；IL-6則位于調控炎癥的樞紐位置，在心肌缺血再灌注損傷中扮演著重要的角色[17]。本研究中養心定悸膠囊預處理的大鼠，SOD水平升高，MDA水平下降，炎癥標志物TNF-α、IL-6水平降低。提示養心定悸膠囊具有減輕心肌缺血再灌注后的炎癥反應，增加SOD水平，抑制缺血再灌注損傷的作用。

綜上所述，養心定悸膠囊預處理對大鼠心肌缺血再灌注損傷具有預防作用，可能與其抗炎、抗氧化作用有關。但是由于樣本量小，觀察時間短，其具體機制仍有待進一步深入研究。