清熱活血藥對急性腦缺血再灌注大鼠MAPK通路的影響

陳寶鑫，傅 晨，張昕洋，賀立娟，徐榛敏，劉雪梅

急性腦梗死(acute ischemic stroke，AIS)是臨床最常見的腦血管疾病，約占全部腦血管病的85%，2018年10月發布的《中國腦卒中防治報告(2018)》[1]指出我國40歲及以上人群的腦卒中患病率由2012年的1.89%上升至2016年的2.19%，現患和曾患人數達1 242萬人，每年死于腦卒中的病人高達196萬人。炎癥反應在急性腦梗死過程中起著關鍵作用，其不僅參與腦缺血的病理生理過程，而且被認為是引發加重腦損傷的主要因素之一[2]。中醫學者大多認可瘀血存在于中風病的全過程，既是重要致病因素，又是病理產物。中風火熱論由金元時期劉完素大力倡導，云：“六氣之中，火熱占二，余風、濕、燥、寒諸氣經傳變皆能化熱生火”“中風偏枯者，由心火暴盛而水衰不能制，則火實克金，金不能平木，則肝木勝，而兼于火熱，則卒暴僵仆”。本團隊長期從事中醫藥治療中風病研究，認為火熱與瘀血蘊積是急性腦梗死加重、惡化的主要病因病機。選擇苦碟子注射液作為清熱活血藥的代表藥物進行研究，主要成分為腺苷和黃酮類物質，具有活血止痛、清熱祛瘀的作用，對急性腦梗死的療效優于目前常用的其他藥物[3]。有Meta分析顯示，常規治療基礎上加用苦碟子注射液可以提高急性腦梗死的療效，明顯改善病人神經功能損害程度[4]。本團隊前期臨床研究證實苦碟子注射液可較早、較顯著地降低病人血清白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-18(IL-18)、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)水平，升高白細胞介素-10(IL-10)水平，降低神經元特異性烯醇化酶(NSE)和S100B水平，具有一定的療效[5]。有實驗研究證實，苦碟子注射液可下調大腦中動脈缺血(MCAO)大鼠Toll樣受體-4(TLR-4)依賴性核因子-κB(NF-κB)信號通路發揮功能，降低細胞凋亡，保護大腦免受缺血性損傷[6-7]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路是細胞內重要的信號傳導通路，在腦缺血級聯反應損傷過程中起著關鍵作用。MAPK信號通路主要包括細胞外信號調節激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38。MAPK信號通路和NF-κB信號通路具有相關性，磷酸化p38(p-p38)和磷酸化ERK(p-ERK)活化后由胞質轉位到核內，激活NF-κB，下調p38 MAPK信號通路可抑制NF-κB的過度激活[8]。因此，本研究從NF-κB上游的MAPK通路入手，探討清熱活血藥對急性腦梗死的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康雄性SD大鼠，無特定病原體(SPF)級，體重(230±20)g，購自維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0006。在北京中醫藥大學東方醫院實驗中心飼養，大鼠自由進食、飲水，控制室溫在18～26 ℃，相對濕度40%～70%，每日光照時間12 h。

1.2 藥物與試劑 苦碟子注射液(通化華夏藥業有限責任公司生產，國藥準字Z20025450)，RIPA buffer(R0278，sigma)，蛋白酶抑制劑(11697498001，Roche)，BCA蛋白定量試劑盒(23225，Thermo)，LDS Sample Buffer 4×(NP0007，Thermo)，SDS-PAGE預制膠10%(14100312，Thermo)，預染蛋白(LC5925，Life)，電泳緩沖液(NP0001，Thermo)，轉膜液(NP0006-1，Thermo)， phopho-p38 MAPK兔多克隆抗體(9211，CST)， p38 MAPK兔多克隆抗體(9212，CST)，phopho-JNK兔多克隆抗體(4668，CST)，JNK兔多克隆抗體(9252，CST)，phopho-ERK兔多克隆抗體(9101，CST)，ERK兔多克隆抗體(9102，CST)，羊抗兔二抗(A11011，Invitrogen)，脫脂奶粉(232100，BD)，ECL超敏發光液(WBKLS0500，Millipore)，IL-6試劑盒(MD120792，MDL)，MMP-9試劑盒(MD120284，MDL)。

1.3 儀器 MCAO栓線(A4-243250，北京西濃科技有限公司)，MultiSkan3酶標儀(Thermo)，垂直電泳系統(121201-0899 Thermo)，轉膜系統(153BR6581，Biorad)，凝膠成像分析儀(5000P91DW，Gene)。

1.4 動物模型 采用10%水合氯醛(35 mg/kg)對大鼠進行腹腔注射麻醉，仰臥固定于手術臺上，頸部正中切開，逐層分離組織，暴露左側頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)、頸內動脈(ICA)，永久結扎CCA近心端、ECA根部，微動脈夾暫時夾閉CCA的遠心端，在CCA結扎處遠心端剪一斜口，經此斜口插入頂端光滑成球面的直徑0.24 mm的尼龍線，經CCA分叉處通過ICA入顱至大腦前動脈(ACA)的起始部，從而閉塞大腦中動脈(MCA)的起始部，造成MCA供血相關區的梗死。尼龍線插入深度為(18.5±0.5)mm，結扎CCA遠心端以固定尼龍線和防止出血，逐層縫合皮膚，尼龍線末端暴露在體外。栓塞1.5 h后，拔出尼龍線24 h，模擬急性腦缺血再灌注模型。假手術組除插線10 mm外，其余步驟同模型組。采用Zea Longa神經癥狀評分[8]，選取評分1～3分的大鼠，共39只進入實驗。

1.5 分組與給藥 實驗大鼠隨機分為3組：假手術組、模型組(缺血1.5 h再灌注24 h)、清熱活血藥治療組，每組13只。清熱活血藥治療組給予腹腔注射苦碟子注射液，手術后2 h給藥1次，以后每隔12 h給藥1次，共給藥3次。給藥劑量按照體表面積進行換算，dB(mg/kg)=dA×(RB/RA)×(WA/WB)1/3，其中dB是大鼠的千克體重劑量，dA是人的千克體重劑量，WA、WB是已知人和大鼠的體重，RA、RB是體型系數(RA=0.1，RB=0.09)。由此計算出大鼠給予苦碟子注射液3.6 mL/kg(本團隊先前發表的文章也證實此劑量安全有效[6-7])，假手術組和模型組給予等體積的生理鹽水。

1.6 神經功能評價 每組取10只大鼠進行神經功能評價。采用Garcia JH評分[9]評價大鼠神經功能，功能正常評分最高，為18分；功能損傷最嚴重評分最低，為3分。

1.7 腦梗死體積 各組大鼠在MCAO造模后24 h取材，使用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，迅速斷頭取腦，-20 ℃冰箱內冷凍10 min，首先去除嗅球和腦干部分，然后自額極開始行2 mm厚連續冠狀切片，均勻切成5片。將切片放入5 mL 1%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染液中，37 ℃避光水浴15 min。待顯色完全，10%多聚甲醛固定腦片30 min，拍照。采用Image J分析軟件對TTC染色照片進行統計分析，腦梗死體積百分比=(各腦切片梗死面積×切片厚度之和)/(各腦切片的面積×切片厚度之和)。每組10只，其中清熱活血藥治療組死亡2只。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot) 取各組大鼠缺血側大腦皮層，加適量含有cocktail蛋白酶抑制劑的裂解液提取組織總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。余蛋白加入適量樣品還原劑、4×上樣緩沖液，95 ℃金屬浴5 min蛋白變性，-80 ℃保存或直接進行實驗。使用SDS-PAGE分離，轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h。加入用5%脫脂奶粉配制的一抗，p-p38兔多克隆抗體(1∶1 000)，p38兔多克隆抗體(1∶2 000)，磷酸化-JNK(p-JNK)兔多克隆抗體(1∶1 000)，JNK兔多克隆抗體(1∶4 000)，磷酸化p-ERK1/2兔多克隆抗體(1∶2000)，ERK1/2兔多克隆抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，PBST漂洗，5 min×3次，加入二抗，山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)，室溫搖床孵育1 h。PBST洗膜，增強化學發光(ECL)顯影曝光。每組3只，實驗重復3次。Image J軟件分析蛋白電泳條帶的光密度值。

1.9 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 取各組大鼠缺血側大腦皮層，ELISA法檢測IL-6、MMP-9。按照試劑盒進行操作。①加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。標準孔7孔，依次加入100 μL不同濃度的標準品。空白孔加100 μL 標準品稀釋液，余孔加待測樣品100 μL，37 ℃溫育1 h，棄液；②各孔加檢測工作液A 100 μL，37 ℃溫育1 h，棄液，洗板3次；③各孔加檢測工作液B 100 μL，37 ℃溫育30 min，棄液，洗板3次；④各孔加入TMB底物溶液90 μL，37 ℃避光孵育10～20 min；⑤各孔加終止溶液50 μL，終止反應；⑥酶標儀450 nm波長測量各孔的光密度值(OD值)。

2 結 果

2.1 各組神經功能缺損程度比較 模型組與假手術組神經功能缺損程度比較差異有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，清熱活血藥治療組神經功能缺損程度改善(P<0.05)。提示清熱活血藥可以改善MACO大鼠神經功能缺損程度。詳見表1。

表1各組大鼠神經功能評分比較

單位：分

2.2 各組腦梗死體積比較 TTC染色發現，模型組和清熱活血藥治療組的腦組織可見明顯白色梗死灶。與模型組比較，清熱活血藥治療組白色梗死區減小，腦梗死體積明顯減小(P<0.01)。結果見表2、圖1。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較(±s) 單位：%

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色觀察腦缺血形態

2.3 各組MAPK蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠缺血側大腦皮層中p-p38、p-ERK1/2蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)；與模型組比較，清熱活血藥治療組p-p38、p-ERK1/2的蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)，而對JNK蛋白表達差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3、圖2。

2.4 各組缺血側皮層炎性因子表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠缺血側大腦皮層中IL-6、MMP-9表達均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，清熱活血藥組IL-6、MMP-9表達均明顯降低(P<0.01)。詳見表4。

表3 各組大鼠缺血側皮層MAPK蛋白表達水平比較

圖2 各組缺血側皮層MAPK及其磷酸化蛋白表達電泳圖

表4 各組缺血側皮層炎性因子表達水平比較(±s)

3 討 論

腦缺血缺氧激活大量炎癥細胞，如小膠質細胞、星形膠質細胞、巨噬細胞等，炎癥細胞產生大量的炎癥相關因子，如IL-6、MMP-9，這些因子又會通過相關細胞信號通路對炎癥細胞起到反饋調節作用，加劇腦細胞的損傷，并破壞了血腦屏障及細胞外基質，而血腦屏障的破壞引起大腦的二次損傷，放大了瀑布式的炎癥級聯反應。IL-6是臨床和實驗研究最多的炎性因子。腦缺血發生后，IL-6水平隨著時間推移而增加，腦缺血3 d達高峰，7 d時仍顯著增高，甚至持續到缺血14 d。IL-6與病人病情嚴重程度、中風嚴重性、梗死體積、不良預后密切相關[10-11]。基質金屬蛋白酶(MMPs)攻擊血管環繞的細胞外基質，促進神經細胞死亡。在腦缺血的早期階段，MMP-9破壞血腦屏障，導致滲漏、白細胞浸潤、腦水腫甚至出血[12]。MMP-9水平的升高可作為腦卒中死亡和預后不良的預測因子[13]。本實驗結果發現，腦缺血大鼠的皮層IL-6、MMP-9明顯升高，清熱活血藥可以降低IL-6、MMP-9水平，這也與本課題組前期研究結果有一致性，前期發現臨床急性腦梗死病人入院3～5 d，苦碟子注射液可明顯降低血清IL-6和MMP-9水平，至第14天，與基礎治療組比較，仍可明顯降低血清MMP-9[5]。

MAPK屬于絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶。主要包括ERK、JNK和p38，其各自介導不同的MAPK信號通路，調節細胞內基因轉錄，參與細胞增殖、分化、凋亡等生理過程，介導生長發育、炎癥反應等生命活動[14-15]。研究發現，在腦梗死早期p38即被激活，在神經元和神經膠質細胞中大量存在。激活后的p38可促進內皮細胞炎性介質和黏附因子的表達，導致血腦屏障的破壞。而產生的炎性介質進一步激活p38，形成正反饋的惡性循環。p-p38是p38信號通路中介導炎癥反應的活性物質。Sugino等[16]研究發現蒙古沙鼠全腦缺血后，海馬CA1區JNK、p38被激活，大劑量的p38抑制劑SB203580能夠適度抑制JNK激活，降低細胞凋亡，提示p38在腦缺血期間的海馬神經元存活和死亡中起重要作用。研究發現，腦梗死會引起時間依賴性的ERK激活，應用ERK抑制劑可以有效降低梗死區炎癥細胞因子的表達和細胞的死亡，發現ERK信號通路可以通過上調MMP-9蛋白的表達來增加血腦屏障的通透性，加重腦損傷。ERK1/2信號通路可通過MAPK激酶(MEK)激活MMP-9，加劇血腦屏障的損傷，從而加重炎癥反應[17]。本研究結果發現，清熱活血藥能夠降低磷酸化的p38、ERK蛋白表達，降低IL-6、MMP-9的表達，說明其可能是通過抑制MAPK蛋白表達，進而降低炎癥反應相關因子IL-6、MMP-9的表達，從而發揮對腦梗死的調節作用。

本課題組認為缺血性中風病病人素體陰虛、復感外邪，致氣機不暢、血失氣煦、內生瘀血；邪從熱化，蘊積化生火熱，火熱內熾，邪熱內陷，煎熬津液，燔灼陰血，生痰生瘀，加重陰虛之候，上述過程相互誘導、促進、加重、惡化，是中風病急性期的重要病因和基本病機。瘀血是中風病急性期的始動病因和病理產物，火熱是進展惡化的重要因素，二者相兼致病，難治難愈。因此，火熱與瘀血蘊積可能是急性腦梗死加重惡化的主要病因病機。本研究發現清熱活血藥對MAPK信號通路的調節作用主要針對p38和ERK1/2的磷酸化，進而影響其下游的炎癥相關因子的表達。另一方面，從結果中可以發現清熱活血藥對MAPK信號通路的調節具有選擇性，具有多靶點調控的特點，而其發揮調節作用的關鍵蛋白p38和ERK1/2將有可能成為腦梗死治療的潛在的靶環節。