新生兒缺氧缺血性腦病血清miR-15b、miR-424表達水平及其臨床意義

張晉雷，薄延橋

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischenic encephalopathy，HIE)是由于新生兒在圍生期窒息缺氧，導致腦部缺氧造成的一系列腦損傷[1]，是新生兒腦病中最常見的疾病之一。HIE患兒大部分都有宮內窘迫史，病情嚴重時可造成新生兒早期死亡、不可逆轉的腦損傷和不同程度后遺癥等，是導致兒童神經系統傷殘的常見病因[2]。研究發現，miRNA在體內穩定存在，不參與轉錄翻譯，適合作為疾病早期診斷的追蹤觀測對象[3]。謝時帥等[4]研究發現，miRNA與中樞神經的發育有關，并在神經系統疾病的發生發展中起重要作用。已有研究表明，miR-424在血管性疾病、中樞神經系統疾病中發揮重要作用[5]，但是對于這兩種微小RNA是否與HIE有關以及其在HIE中表達趨勢的相關研究較少。因此，本研究從檢測miR-15b、miR-424在HIE患兒血清中表達水平入手，探究其與HIE發生、發展和預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年4月—2017年4月我院兒科收治的68例HIE患兒為試驗組，其中男35例，女33例；胎齡36～42(39.87±1.96)周；體重2.71～4.02(3.69±0.41)kg。根據患兒臨床HIE分度標準[6-7]分為輕度組、中度組和重度組，其中輕度組24例，中度組28例，重度組16例。納入標準：①符合HIE診斷標準[6]，確診為新生兒缺氧缺血性腦病；②無宮內感染及先天遺傳性疾病；③臨床及隨訪資料完整。排除標準：①先天發育畸形；②孕婦妊娠期間有各種急慢性感染及宮內感染史，嚴重肝、腎功能不全，惡性腫瘤，自身免疫性疾病，惡性心律失常，產后7 d內出現產后并發癥；③產傷性顱內出血。同時選取我院68名同期分娩的健康嬰兒為對照組，其中男37名，女31名；胎齡38～41(40.15±0.89)周；體重2.89～3.87(3.61±0.32)kg。兩組性別、胎齡、出生體重等比較差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。詳見表1。本研究經我院倫理委員會批準通過，所有樣品采集均取得受試新生兒家長知情同意并簽字，符合世界醫學協會《赫爾辛基宣言》。

表1 兩組臨床資料比較

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司，批號：DP443)；miScript SYBR?Green Mix試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司，批號Q221-01)；引物由上海生工生物公司設計合成；qRT-PCR儀(美國Bio-Rad公司生產，型號CFX96)。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集及保存 入選新生兒均于出生后48 h內抽取股靜脈血3 mL置于紅色采血管中，3 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min后，取上清液分裝于EP管中，-80 ℃保存備用。

1.3.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-15b、miR-424表達水平 采用qRT-PCR檢測HIE患兒和健康新生兒血清中miR-15b、miR-424水平。采用RNA提取試劑盒提取HIE患兒血清總RNA，反轉錄得到cDNA。采用定量PCR儀對miR-15b和miRNA-424進行擴增。qRT-PCR反應體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，雙蒸水(dd H2O)3.0 μL。反應條件為95 ℃、90 s，95 ℃、30 s，63 ℃、30 s，72 ℃、15 s，40個循環。采用2-△△CT法對miR-15b、miR-424表達水平進行定量分析。引物序列見表2。

表2 qRT-PCR引物序列

1.3.3 新生兒神經行為測量(Neonatal Behavioral Neurological Assessment，NBNA)評分測定 試驗組HIE患兒在出生后28 d測定NBNA評分[8]。NBNA評分包括6項行為能力評分、4項被動肌張力評分、4項主動肌張力評分、3項原始反射評分及3項一般狀態評分。每項評分分值為0～2分，總分40分，>37分表示神經功能正常，35～37分為臨界異常，<35分為異常。

1.4 隨訪 所有HIE患兒均接受門診復診或電話隨訪，每3個月隨訪1次，隨訪2年，截止時間為2019年5月1日。隨訪期間無患兒失訪。隨訪期間測定并記錄患兒NBNA評分、腦性癱瘓和癲癇發病情況、生存情況。根據隨訪情況分為預后良好組和預后不良組。預后不良為患兒發生下列其中1項：NBNA評分<35分、腦性癱瘓、癲癇或死亡[9-10]。

2 結 果

2.1 HIE患兒和健康新生兒血清miR-15b、miR-424表達水平比較 HIE患兒血清miR-15b、miR-424表達水平均明顯低于健康新生兒(P<0.05)。詳見表3。

表3 HIE患兒和健康新生兒血清miR-15b、miR-424表達水平比較(±s)

2.2 不同嚴重程度HIE患兒血清miR-15b、miR-424表達水平比較 與輕度組比較，重度組、中度組HIE患兒出生后28 d血清miR-15b、miR-424表達水平明顯降低(P<0.05)；與中度組比較，重度組HIE患兒出生后28 d血清miR-15b、miR-424表達水平均明顯降低(P<0.05)。詳見表4。

表4 不同嚴重程度HIE患兒血清miR-15b、miR-424表達水平比較(±s)

2.3 不同病情嚴重程度HIE患兒出生后28 d NBNA評分比較 重度組、中度組出生后28 d NBNA評分低于輕度組(P<0.05)。重度組出生后28 d NBNA評分低于中度組(P<0.05)。詳見表5。

表5 不同病情嚴重程度HIE患兒出生后28 d NBNA評分比較(±s) 單位：分

2.4 miR-15b、miR-424表達水平與出生后28 d NBNA評分的相關性分析 相關性分析顯示，HIE患兒miR-15b、miR-424表達水平與出生后28 d NBNA評分均呈正相關(r=0.256，P<0.05；r=0.317，P<0.05)。詳見表6。

表6 miR-15b、miR-424表達水平與NBNA評分的相關性分析

2.5 血清miR-15b、miR-424表達水平與HIE患兒預后關系 預后良好組HIE患兒血清miR-15b、miR-424高表達率均明顯高于預后不良組患兒(P<0.05)。詳見表7。

表7 血清miR-15b、miR-424表達水平與HIE患兒預后關系 單位：例(%)

3 討 論

HIE在新生兒中多見，發病率為活產足月兒的0.3%～0.6%[11]。根據HIE臨床分度可將HIE患兒分為輕度、中度、重度。HIE會導致不同程度的后遺癥，與患兒后遺癥嚴重程度、預后有關的因素有許多，如臨床分度、NBNA評分、介入治療時間等。造成HIE的原因很多[12]，如圍產期宮內窘迫、難產等。在分娩過程中發生窒息經過搶救，并及時采取相應治療措施后，可控制HIE的發生，但是對于嚴重窒息的嬰兒，HIE發病率依然很高，窒息缺氧直接導致嬰兒腦部供血不足，此時腦部區域糖酵解作用大幅度增加[13]，腦細胞氧化代謝受損；同時，腦血管自動調節功能減退，血管周圍的細胞病變導致管腔變窄甚至閉塞，腦部形成不可逆性損傷，導致預后不良。因此，探究HIE的發病機制，尋找有效應對措施和治療方法是目前的研究熱點。

miR-15b是miR-15/16家族成員一員[14]，在機體各系統、特別是血管內皮系統廣泛表達，主要影響細胞增殖、凋亡、侵襲、成管能力等。已有研究表明，在動物模型和體外實驗中，miR-15b與血管形成、細胞凋亡等調節有關[15-16]。黃姿等[17]研究發現不穩定型心絞痛、急性ST段抬高型心肌梗死病人血漿中miR-15b表達水平降低，說明miR-15b與急性冠脈綜合征病人冠狀動脈病變嚴重程度有關。Zhu等[14]研究表明miR-15b有抗血管生成的作用。本研究發現HIE患兒血清miR-15b表達相對于對照組下調，說明miR-15b可能與HIE發生有關。麥友剛等[18]在肺成纖維細胞研究中發現，miR-15b過表達可抑制血管內皮生長因子(VEGF)表達水平，參與支氣管發育不良過程。王薇等[19]研究表明，VEGF參與HIE病理生理過程，VEGF可聯合突變型低氧誘導因子促進血管新生[20]。本研究發現，HIE患兒血清miR-15b表達水平與HIE患兒28 d NBNA分值呈正相關，提示miR-15b可能反映HIE患兒病程的發展。進一步研究發現，預后良好組HIE患兒血清miR-15b高表達率均明顯高于預后不良組患兒，提示miR-15b低表達可能與HIE患兒的不良預后有關。

Chen等[21]研究發現，miR-424可調節缺氧誘導因子表達，減輕小鼠缺血性腎損傷，對缺血性再灌注損傷有保護作用。本研究發現，miR-424在HIE患兒血清中表達水平較對照組明顯下降，說明miR-424可能與HIE的發生有關。進一步研究發現，miR-424的表達與HIE患兒分度有關，提示miR-424可能參與HIE病情的發生發展。郜樂樂等[5]在急性腦梗死研究中發現，miR-424在急性腦梗死病人中表達下調，且表達水平與急性腦梗死患病程度有關。本研究發現，miR-424的表達水平隨HIE病情嚴重程度上升而下降，且與HIE患兒出生后28 d NBNA評分呈正相關，說明miR-424可能參與HIE病程的發展。進一步研究發現，與預后良好組相比，預后不良組HIE患兒血清miR-424高表達率明顯降低，提示miR-424可能與HIE患兒預后有關。

綜上所述，HIE患兒血清中miR-15b、miR-424表達較對照組下調，與臨床分度、出生后28 d NBNA評分有關，對預后有影響，可能在HIE的發展過程中發揮一定作用。本研究不足之處為統計樣本量不足，后期將增加樣本量對miR-15b、miR-424在HIE疾病進展中的作用進行深入研究。