高效液相色譜-電感耦合等離子體質譜法測定海產調味品中無機砷的含量

孫勝枚，談詠南，鄧悅峰

(李錦記(新會)食品有限公司，廣東 江門 529156)

現今人們的生活條件越來越好，對生活品質的追求也越來越高，特別是在食品的選擇上，越來越注重食品安全問題。美食佳肴琳瑯滿目，但美食的背后不可或缺的是萬千調味品，所以調味品的食品安全問題不容忽視，更值得關注。

砷是GB 2762-2017《食品安全國家標準 食品中污染物限量》中的食品安全項目，包括總砷和無機砷。自然界中砷主要以無機砷和有機砷的形式存在，無機砷包括亞砷酸鹽As(Ⅲ)和砷酸鹽As(Ⅴ)，有機砷包括二甲基砷酸DMA、一甲基砷酸MMA、三甲基砷酸TMAO、砷膽堿 AsC和砷甜菜堿AsB[1]。國際癌癥研究機構(IARC)將亞砷酸鹽As(Ⅲ)和砷酸鹽As(Ⅴ)列為Ⅰ級致癌物[2]，其中亞砷酸鹽As(Ⅲ)的毒性大于砷酸鹽As(Ⅴ),而砷酸鹽As(Ⅴ)的毒性又大于有機砷，可溶性砷毒性大于不溶性砷[3]，而且As(Ⅲ)的毒性約為As(Ⅴ)的60倍[4]。綜上所述，無機砷的毒性遠大于有機砷。

海產品中砷含量很高，但主要以有機砷形式存在。同理，海產調味品中砷含量也很高，因此分離檢測海產調味品中無機砷的含量，對評價海產調味品食品安全風險有重大意義。目前對于無機砷檢測方法的國家標準方法有GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》和GB/T 23372-2009《食品中無機砷的測定 液相色譜-電感耦合等離子體質譜法》，以及一些期刊文獻中對香菇、大米、蝦油、藻類和海產品中砷形態的測定[5-9]。國標法適用于常規的調味品食品檢測，對于基質非常復雜的海產調味品，其高鹽、高油或高蛋白特性使得國標法對海產調味品的檢測存在一定局限性，目前還未發現針對海產調味品的無機砷含量測定的相關研究報道，本方法針對海產調味品優化國標前處理方法，解決了存在的干擾因素，對建立海產調味品中無機砷含量的檢測方法意義重大。

1 材料與方法

1.1 試劑

濃硝酸：優級純，濃度≥65%，為了得到高純度的酸，使用前經亞沸蒸餾儀蒸餾備用；過氧化氫：CMOS級，濃度≥30%；氨水：ICP-MS級，濃度≥25%；三價砷標準溶液、五價砷標準溶液：品牌：Inorganic Ventures；砷甜菜堿標準溶液、一甲基砷標準溶液、二甲基砷標準溶液：研制單位：中國計量科學研究院；超純水：經過超純水機制得，電阻率≥18.2 MΩ·cm；陰離子交換分析色譜柱和陰離子交換分析色譜保護柱(品牌：Prin-cen)。

液氬或高純氬氣:純度≥99.999%；高純氦氣：純度≥99.999%。

1.2 儀器

Agilent ICP-MS 7900電感耦合等離子體質譜儀；Agilent 1260高效液相色譜儀；萬分之一分析天平(精度0.0001 g，品牌:賽多利斯)；一次性注射器；水浴鍋：溫度可調至100 ℃；一次性塑料樣品瓶；帶蓋的50 mL塑料離心管、50 mL和1000 mL容量瓶，每次使用前至少在10%的硝酸中泡12 h，用蒸餾水洗干凈，在室溫下自然晾干備用；0.45 μm尼龍66濾膜過濾器；超純水機(Milli-Q)。

1.3 電感耦合等離子體質譜儀工作參數

使用的儀器為Agilent 7900電感耦合等離子體質譜儀(包括屏蔽炬、MicroMist霧化器),檢測質量數m/z=75(As)，m/z=35(CL)，采集時間為0.5 s，具體參數見表1。

表1 電感耦合等離子體質譜儀工作參數Table 1 The working parameters of ICP-MS

1.4 液相色譜條件

1.4.1 色譜柱

陰離子交換分析色譜柱(柱長50 mm，內徑4.6 mm，品牌：Prin-cen)和陰離子交換分析色譜保護柱(柱長50 mm，內徑4.6 mm，品牌：Prin-cen)。

1.4.2 流動相

流動相A: 5 mmol/L的硝酸銨溶液；流動相B：60 mmol/L的硝酸銨溶液。洗脫方式：梯度洗脫(見表2)。進樣體積：10 μL。

表2 洗脫程序Table 2 The elution procedure

1.5 樣品處理方法

稱取1.0 g樣品于塑料離心管中，加入20 mL含3%過氧化氫0.15 mol/L硝酸混合溶液，于90 ℃水浴60 min，冷卻至室溫，加氨水調節pH至弱堿性，然后以6000 r/min離心10 min后取上清液，用0.45 μm濾膜過濾至塑料樣品瓶待測，按同一操作方法做空白試驗。

2 結果與討論

2.1 陰離子色譜分析柱的篩選

為了選擇分離效果更好的陰離子分析柱，對Hamilton、Agilent 和Prin-cen 3種品牌的陰離子色譜分析柱進行試驗。

2.1.1 Agilent陰離子交換柱

根據國標法GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》中HPLC-ICP-MS法的色譜條件用Agilent陰離子交換柱對DMA、As(Ⅲ)、MMA和As(V)的混合標準溶液分離，色譜圖見圖1。

圖1 4種砷形態標準溶液色譜圖(20 μg/L)Fig.1 The chromatogram of standard solution in 4 arsenic species(20 μg/L)

分離所用時間為12 min，由圖1可知，DMA 和As(Ⅲ)的保留時間比較接近，分離度不高，兩個色譜峰靠得太近，往往會由于一個峰的峰面積太大而影響另一個峰的峰形，互相干擾而無法判斷色譜峰拐點，不利于色譜峰的積分，從而不能準確定量。

2.1.2 Hamilton PRP-X100陰離子交換柱

使用Hamilton PRP-X100陰離子交換柱對As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的混合標準溶液分離，色譜圖見圖2。

圖2 5種砷形態標準溶液色譜圖(5 μg/L)Fig.2 The chromatogram of standard solution in 5 arsenic species(5 μg/L)

由圖2可知，AsB、MMA和As(Ⅲ)靠得太近，保留時間相差0.5～0.6 min，同樣會由于一個峰的峰面積太大而影響另一個峰的峰形，互相干擾而無法判斷色譜峰拐點，分離時間接近12 min。

2.1.3 Prin-cen陰離子交換柱

使用Prin-cen陰離子交換柱對As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的混合標準溶液分離，色譜圖見圖3。

圖3 5種砷形態標準溶液色譜圖(5 μg/L)Fig.3 The chromatogram of standard solutions in 5 arsenic species(5 μg/L)

由圖3可知，5種砷形態分離度高，分析所用時間為6 min,大大地提高了檢測效率。

綜上所述，Prin-cen陰離子色譜柱雖柱子短，但分離效果好，分離時間大大縮短，僅為6 min，能有效地提高檢測效率。

2.2 As(Ⅲ)的影響因素

海產調味品樣品基質復雜，高鹽是其主要特點之一(如蝦醬)，所以本試驗通過純水和氯化鈉-硝酸溶液作溶劑分別配制標準溶液，對As(Ⅴ)和As(Ⅲ)的影響因素進行考察，結果發現采用氯化鈉溶液配制的標準溶液中，As(Ⅲ)的峰形變寬、變矮，呈扁平狀，見圖4中b。值得注意的是，在接近4 min時有一個ArCl的分子離子干擾峰出現，但能被分離，不影響目標峰的定性和定量。

圖4 1 μg/L 5種砷標準圖 Fig.4 The chromatograms of standard solutions in 5 arsenic species(1 μg/L)

2.3 As(Ⅴ)的影響因素

2.3.1 C18小柱對五價砷的影響

國標法GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》中HPLC-ICP-MS法的前處理步驟中需要用C18小柱凈化樣品，為了驗證C18小柱對五價砷的影響進行了以下試驗:

以純水為溶劑配制的砷5種形態的混合標準溶液通過C18凈化小柱(品牌：CNW)凈化后上機分析，結果發現As(Ⅴ)損失近50%，而其他砷形態基本沒損失，疊圖見圖5(淺色是未過C18小柱的色譜圖，深色是過C18小柱的色譜圖)。

圖5 5 μg/L 5種砷標準疊圖Fig.5 The chromatogram of standard solutions in 5 arsenic species(5 μg/L)

因樣品試液含0.15 mol/L HNO3，所以以0.15 mol/L HNO3為溶劑配制的砷5種形態的混合標準溶液，通過C18小柱凈化后上機分析，結果發現經C18小柱處理后As(Ⅴ)損失近10%，而其他砷形態基本不損失。

通過試驗證明C18小柱無論對水基體或者酸基體的As(Ⅴ)均有不同程度的吸附，嚴重者損失近50%，所以本方法將不使用C18小柱。

2.3.2 酸基體環境對系統中As(Ⅴ)的影響

為了試驗酸基體環境對系統中As(Ⅴ)的影響，通過分析以0.15 mol/L HNO3為溶劑配制20 μg/L的As(Ⅴ)單標溶液，然后連續分析0.15 mol/L HNO3的空白溶液，數據見表3。

表3 酸基體對As(Ⅴ)的殘留試驗Table 3 The residue test of As (Ⅴ) on acid matrix

由表3可知，在酸基體中系統中As(Ⅴ)有殘留，且不容易清洗干凈，結論是含As(Ⅴ)高濃度樣品會對下一個樣品造成影響。根據Prin-cen陰離子交換色譜柱的pH適用范圍在7～13之間，說明酸基體的樣品進入系統后影響了流動相中緩沖鹽的緩沖能力，從而導致pH改變，影響了色譜柱的性能。

2.3.3 弱堿性基體環境對系統中As(Ⅴ)的影響

為了驗證弱堿性基體環境對系統中As(Ⅴ)的影響，用氨水將2.3.2中的標準溶液調節為弱堿性，儀器分析完標準溶液后，分析方法空白(用氨水將0.15 mol/L HNO3調節為弱堿性)，結果發現系統中As(Ⅴ)基本沒有殘留，數據見表4。證明調節樣品的pH值至弱堿性的方法能避免As(Ⅴ)在系統中殘留。

表4 堿基體對As(Ⅴ)的殘留試驗Table 4 The residue test of As(Ⅴ)on alkali matrix

2.4 前處理方法優化——提取液選擇

為了尋求適用于海產調味品的無機砷含量檢測的前處理方法，分別考察了GB/T 23372-2009《食品中無機砷的測定 液相色譜-電感耦合等離子體質譜法》和GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》的前處理方法，進行了以下試驗。

2.4.1 純水-熱浸提取法

參考GB/T 23372-2009《食品中無機砷的測定 液相色譜-電感耦合等離子體質譜法》前處理方法，其特點是用純水-熱浸提，試驗如下：

通過分析大米粉成分標準物質(GBW(E)100348)，見圖6中b。檢測結果：As(Ⅲ)108 μg/kg和As(Ⅴ)62 μg/kg，無機砷總量為0.17 mg/kg，而大米無機砷理論值為(0.18±0.03)mg/kg，無機砷總量的檢測結果在允許范圍內。

圖6 大米粉成分標準物質色譜圖Fig.6 The chromatograms of standard substances of rice flour

通過分析以蝦醬為代表的海產調味品得到色譜圖，見圖7中a，發現As(Ⅲ)峰寬大,但As(V)分離較好，不受影響；通過添加As(Ⅲ)和As(V)混標再次確認As(Ⅲ)和As(V)的保留時間，見圖7中b。經采用過氧化氫將As(Ⅲ)轉化為As(V)，見圖7中c，結果發現原As(Ⅲ)峰位置確實存在雜質干擾，As(Ⅲ)存在假陽性。

圖7 蝦醬(a)、蝦醬加標(b)、蝦醬使用過氧化氫 氧化法(c)的色譜圖Fig.7 The chromatograms of shrimp sauce(a), spiked shrimp sauce(b)and shrimp paste oxidized by hydrogen peroxide(c)

綜上所述，GB/T 23372-2009《食品中無機砷的測定 液相色譜-電感耦合等離子體質譜法》前處理方法只適用于大米等植物性樣品的檢測，但處理蝦醬等高鹽的基質復雜的水產動物類樣品時，因As(Ⅲ)峰有干擾，檢測還存在一定局限性，可以采用過氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以As(V)計算無機砷總量。

2.4.2 硝酸-熱浸提取法

參考GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》前處理方法,其特點是采用0.15 mol/L硝酸-熱浸提，試驗如下:

通過分析大米粉成分標準物質(GBW(E)100348)，見圖6中c，發現在As(Ⅲ)處不出峰，無法定量，但As(V)分離較好，不受影響。但采用過氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)后，以As(V)計算無機砷總量，檢測結果符合理論值。

同樣，處理蝦醬產品的色譜圖時(見圖8中b)，通過添加As(Ⅲ)和As(V)混標再次確認As(Ⅲ)和As(V)的出峰時間，見圖8中 c，發現在As(Ⅲ)處仍然不出峰，無法定量，但As(V)能定性且分離較好，不受影響。

圖8 As(Ⅲ)和As(V)混標(a)、蝦醬(b)、 蝦醬加標(c)色譜圖Fig.8 The chromatograms of mixed standard solution As(Ⅲ)and As(V), shrimp sauce(b) and spiked shrimp sauce(c)

綜上所述，采用兩種國標方法都存在著局限性，主要體現在As(Ⅲ)不能分離或者出現干擾，而As(V)沒有影響，因此本試驗結論是可以用過氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以避免對As(Ⅲ)的影響，最后以As(V)計算無機砷總量。

2.5 提取效率

根據以上結論采用過氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以避免對As(Ⅲ)的影響，分別考察了純水-熱浸提加氧化法和0.15 mol/L HNO3-熱浸提加氧化法的提取效率，試驗通過對大米粉成分標準物質(GBW(E)100348)和DORM4-魚蛋白進行對比，平行測定7次，結果發現，以0.15 mol/L HNO3-熱浸提加氧化法的檢測結果更接近理論值，數據見表5。

表5 提取效率對比Table 5 The comparison of extraction efficiency

2.6 準確度、精密度與回收率

對大米粉成分標準物質(GBW(E)100348)進行分析以驗證方法的準確度并計算其變異系數，平行測定7次，數據結果見表6，結果均符合證書要求。對3種海產調味品：蝦醬(高鹽類)、沙茶醬(高油類)、蠔油(高蛋白類)進行3個水平的加標回收試驗,并計算其相對標準偏差，數據結果見表7。

表6 大米粉標準物質分析結果Table 6 The analysis results of rice flour reference materials

表7 樣品加標回收分析結果(n=7)Table 7 The analysis results of sample spiked recovery rates(n=7)

3 結論

本方法選用Prin-cen陰離子交換色譜短柱，在6 min內實現As(Ⅲ)、As(Ⅴ)、MMA、DMA和AsB的有效分離，能有效提高檢測效率,在國標GB 5009.11-2014《食品安全國家標準 食品中總砷及無機砷的測定》前處理方法基礎上進行優化，通過含3%過氧化氫0.15 mol/L硝酸溶液混合溶液提取樣品,同時過氧化氫將As(Ⅲ)氧化為As(V)，以避免酸基體和鹽基體對As(Ⅲ)的影響，然后將樣品試液調節至弱堿性以解決As(V)的系統殘留問題，最后以As(V)計算無機砷總量。試驗結果表明本方法簡單快捷、準確可靠，適用于海產調味品中無機砷的檢測。