正交試驗優化黑米黃酮的提取工藝

劉麗珍，劉建霞，劉文英，米智*，車鋒，田計軍

(1.山西大同大學 生命科學學院，山西 大同 037009；2.山西大同大學 應用生物技術研究所，山西 大同 037009)

黑米是一種黑稻加工產品，為禾本科植物非糯性稻，經長期培育而成[1-2]。與普通白米相比，黑米所含無機鹽高1～3倍；蛋白質高46%～66%，其氨基酸組成接近于人體；更含有白米缺乏的特殊成分，如花青素、胡蘿卜素、葉綠素和強心甙等[3-4]，因而更具營養和保健功能[5]，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美譽。黑米還具有清除自由基、抑制癌細胞生長、免疫調節、降低動脈硬化、預防心腦血管疾病等多種生理功能[6-7]。《本草綱目》記載：黑米有“滋陰補腎，健身暖胃，明目活血，補肺緩筋”等藥效；對頭昏目眩、腰膝酸軟、夜盲耳鳴癥等的療效尤佳。黃酮類化合物的基本母核是2-苯基色原酮[8]，為植物的重要次生代謝產物，無法自主合成，只能從日常食物中攝取，多存在于水果、蔬菜、谷物、豆類和茶葉中[9-11]，具有高度的化學反應性能，能夠清除體內自由基、抗菌消炎、改善血液循環等[12-14]。黑米黃酮化合物可維持血管的滲透壓，降低血管脆性，防止血管破裂，消炎止血及提高免疫力等。

目前，黃酮的提取方法有長期浸出法、超聲波提取法、酶提取法、水蒸氣蒸餾法等，這些方法花費時間長、溶劑用量大、效率不高。本試驗采用的索氏提取法具有選擇性好、能耗低、設備簡單、操作方便等優點。黃酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有機溶劑，但甲醇、丙酮有一定的毒性，乙醇無毒、沸點低，且作為提取劑回收利用方便，可降低成本[15-17]。本研究以黑米為原料，利用索式提取法提取黃酮并通過正交試驗優化最佳提取條件，為黑米黃酮在食品、藥品研究領域提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑米：山西省農業科學院高寒區作物研究所；蘆丁標準品(純度>98%)：上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、Al(NO3)3·9H2O、NaNO2、NaOH：均為分析純。

1.2 儀器與設備

9070MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司；XFB-200型小型中藥粉粹機 吉首市中誠制藥機械廠；JA5003B型精密電子分析天平 上海精科天美科學儀器有限公司；SHSL型電熱套 上海樹立儀器儀表有限公司；250 mL索氏提取器、UV-1200型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 蘆丁標準曲線的制作

稱取10 mg干燥的蘆丁標準品，加無水乙醇搖勻，充分溶解并定容至50 mL，得 0.2 mg/mL 蘆丁標準液，置于4 ℃冰箱中保存。同時做空白對照，在510 nm處測其吸光度，重復3次，制作標準曲線，見表1。

表1 蘆丁標準曲線的制作Table 1 The making of rutin standard curve

1.3.2 黑米的選擇及黃酮提取工藝

選用有光澤、米粒大小均勻、無爆腰、飽滿度好、無蟲、不含雜質的黑米。將黑米用小型中藥粉碎機粉碎后過60目篩，包濾紙分裝，收集于干凈的塑封袋中。粉末稱重→索式提取→提取液定容→測吸光度→計算提取率。

1.3.3 黑米總黃酮的測定方法

準確吸取1 mL的上述待測液，用分光光度計測樣品液的吸光度，重復3次，方法同1.3.1，代入回歸方程計算出黑米黃酮的提取率。

式中：P表示提取液黃酮質量濃度，mg/mL；N表示稀釋倍數；V表示提取液總體積，mL；M表示樣品質量，mg。

1.3.4 單因素試驗1.3.4.1 乙醇濃度

準確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在液料比為30∶1、回流時間為2 h、提取次數為3次的條件下，設定乙醇濃度為30%、40%、50%、60%、70%、80%索式提取黑米總黃酮，測定所提取溶液的吸光度。考察不同乙醇濃度時黃酮的提取率。

1.3.4.2 液料比

準確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇濃度為60%、回流時間為2 h、提取次數為3次的條件下，設定液料比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 (mL/g)索式提取黑米中的總黃酮，測定所得溶液的吸光度。考察不同液料比時黃酮的提取率。

1.3.4.3 提取次數

準確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇濃度為60%、回流時間為2 h、液料比為30∶1的條件下，設定提取次數為1，2，3，4，5次提取黑米中的總黃酮，測定所得溶液的吸光度。考察不同提取次數時黃酮的提取率。

1.3.4.4 回流時間

準確稱取黑米粉末(4.000±0.001) g，在乙醇濃度為60%、液料比為30∶1、提取次數為3次的條件下，設定回流時間為0.5，1，1.5，2，2.5 h提取黑米中的總黃酮，測定所得溶液的吸光度。考察不同回流時間時黃酮的提取率。

1.3.5 黑米總黃酮提取工藝的正交試驗

在乙醇濃度、液料比、提取次數和回流時間 4個單因素中，分別選取3個影響最大的因素為水平，做 L9(34)正交試驗，重復3次，以考察黑米黃酮的最佳提取條件。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的制作

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 The standard curve of rutin

由圖1可知，標準曲線的橫坐標為蘆丁標準品濃度(P，m/V)，縱坐標為其吸光度值，得到回歸方程：y=12.473x+0.0151，R2=0.9955，呈良好的線性關系。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇濃度對黑米黃酮提取率的影響

圖2 乙醇濃度對黃酮提取率的影響Fig.2 The effect of ethanol concentration on the extraction rate of flavonoids

由圖2可知，黑米黃酮提取率隨著乙醇濃度的不斷加大而增加；乙醇濃度在60%時，黃酮的提取率為最大值4.46%；之后乙醇濃度繼續加大，黃酮的提取率反而下降。這可能是因為溶劑體積分數的升高增加了乙醇對黑米的滲透性和對細胞膜的破壞性，從而增大了黃酮類化合物的溶解度，提取率也相應增大；在乙醇濃度為60%時，提取率達到最高；當乙醇濃度繼續增加會使一些醇溶性色素、脂溶性物質和糖類等雜質溶出，從而降低了黃酮物質的溶解，導致黑米黃酮類物質提取率下降[18]。因此在做正交試驗時，分別選取乙醇濃度為 50%、60%、70%做3個水平。

2.2.2 液料比對黑米黃酮提取率的影響

圖3 液料比對黃酮提取率的影響Fig.3 The effect of liquid to solid ratio on the extraction rate of flavonoids

由圖3可知，黑米黃酮提取率隨著液料比的增加而增大；當液料比為30∶1時，黑米黃酮提取率達到最大值，約為4.46%；隨著液料比的繼續增加，黃酮提取率反而降低。可能是因為液料比過小時，溶劑尚未與樣品充分接觸；隨著液料比的增大，溶劑與樣品接觸達到最大；之后隨著液料比的進一步加大，細胞破裂程度下降，黑米黃酮類物質分子的溶出已達飽和，溶出的其他雜質與黃酮溶出物形成競爭，且被溶解的黃酮發生變性分解，這些導致了黃酮提取率的下降[19]。因此在做正交試驗時，選取液料比為20∶1、30∶1、40∶1做3個水平。

2.2.3 提取次數對黑米黃酮提取率的影響

圖4 提取次數對黃酮提取率的影響Fig.4 The effect of extraction times on the extraction rate of flavonoids

由圖4可知，隨著黑米黃酮提取次數的增加,提取率呈上升趨勢，當提取次數為4次時，黃酮的提取率達到最大，約為3.47%；超過4次后，黑米黃酮的提取率開始下降。因此做正交試驗時，選擇提取次數為3，4，5次做3個水平。

2.2.4 回流時間對黑米黃酮提取率的影響

圖5 回流時間對黃酮提取率的影響Fig.5 The effect of reflux time on the extraction rate of flavonoids

由圖5可知，回流時間在0.5～1.5 h之內，黑米黃酮的提取率呈上升趨勢；1.5 h時，黑米黃酮提取率達到最高值，約為5.42%；當回流時間超過1.5 h時，黑米黃酮的提取率開始下降。因此選擇回流時間為1，1.5，2 h做正交試驗。

2.3 正交試驗結果

綜合單因素試驗結果，以乙醇濃度、液料比、提取次數、回流時間為考察因素，以黃酮提取率為指標，做4因素3水平正交試驗，重復3次，結果見表2。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表Table 2 The factors and levels of L9(34)orthogonal test

表3 正交試驗結果與分析Table 3 The results and analysis of orthogonal test

由表3可知，黑米黃酮的最佳組合為A1B2C2D2，由極差值R可知，索式提取黑米黃酮的影響順序為B>D>A>C。即乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，提取次數為4次，回流時間為1.5 h時，黃酮的提取率最大。用優化的組合重復3 次做驗證試驗，得出的提取率為 5.71%。

表4 方差分析表Table 4 Analysis of variance table

由表4可知，索式提取法提取黑米黃酮的4個因素對黃酮的提取率影響不顯著。

3 結論

本試驗運用索式提取法提取黑米中的黃酮，根據單因素試驗結果和正交試驗得出了最佳工藝條件：乙醇濃度為50%，液料比為30∶1，提取次數為4次，回流時間為1.5 h時，該條件下，黃酮提取率最高，達5.71%。影響順序為B>D>A>C，4個因素對黑米黃酮提取的影響均不顯著。驗證試驗說明該結果可靠，為黑米黃酮的進一步研究提供了理論依據。