?規模化養豬場沼液中原核微生物的分離與鑒定?

?鄒坤 楊佳玨 趙彩宏 謝倫宏 賀愛蘭

摘 要：為充分利用規?；B豬場的沼液資源，防止農業面源污染，采集了婁底市周邊的4個豬場發酵罐出口和曝氣池出口處的沼液進行原核微生物的分離與鑒定，并對從中分離純化出的大腸桿菌K-12、大腸桿菌IAI和枯草芽孢桿菌 PS832進行了理化性質和相關抗性研究。結果表明：大腸桿菌K-12對氨芐青霉素和卡那霉素具有一定的抗性;大腸桿菌IAI對氨芐青霉素和鏈霉素不敏感，但對慶大霉素和卡那霉素敏感;枯草芽孢桿菌 PS832對氨芐霉素、卡那霉素和慶大霉素敏感，對鏈霉素不敏感。此外，研究顯示用200 W超聲波間斷性處理這3類菌株20～30次（工作10 s、間歇10 s為1次）可以達到理想滅菌效果。

關鍵詞：規?；B豬場;沼液;原核微生物;理化分析

中圖分類號：S828; X713文獻標識碼：A文章編號：1006-060X（2020）10-0067-05

Abstract： Biogas slurry is rich in nitrogen， phosphorus， potassium and other physiological active substances， but harmless treatment is difficult. How to use it as resources is an important content of agricultural non-point source pollution control. In this paper， the biogas?slurry at the outlets of fermentation tanks and aeration tanks of four pig farms around Loudi City was sampled. Escherichia coli K-12，?Escherichia coli IAI and Bacillus subtilis PS832 were obtained from biogas slurry through isolation and purification， and their physicochemical properties and related resistances were determined. The results show that Escherichia coli K-12 is resistant to ampicillin and kanamycin; Escherichia coli IAI is not sensitive to ampicillin and streptomycin， but sensitive to gentamicin and kanamycin; Bacillus subtilis PS832 is sensitive to ampicillin， kanamycin and gentamicin， but not sensitive to streptomycin. The ideal sterilization for the 3 types of bacteria could be achieved by periodic treatment with 200 W ultrasonic waves for 20-30 times （each time run for 10s with a 10s interval）.

Key words： large-scale pig farms; biogas slurry; prokaryotic microorganism; physicochemical analysis

沼氣發酵技術在我國應用歷史長久，在各級政府政策和財政的支持下，各類沼氣工程連續幾年迅猛發展，帶來了大量的生物能源，減少了農用廢棄物，增加了經濟效益，但與此同時，沼氣工程在產生沼氣的同時，大量的沼液隨之產生，如何合理利用使之變廢為寶，成為急待解決的另一個課題[1]。已有研究發現，沼液中含有豐富的營養物質及微量元素，沼液的主要利用方式則包括直接歸田或與其他肥料配合歸田[2]、沼液浸種[3]、葉面肥[4]、飼料添加劑等。與沼渣相比，沼液的養分含量較低，且不易運輸，儲藏，具有二次產氣等特點，無害化處理難度較大， 因此，有必要了解不同地區以及以不同底物發酵的沼液的理化性質及特性，為其合理利用提供理論依據。此外，沼液中含有種類豐富，數量巨大的微生物，并被證實具有增產和改善農作物品質的作用，具有生物肥料和生物農藥的雙重功效[5-7]。近年來相關學者進行了沼液中微生物的分離，從沼液中分離出一株酵母菌，并對其分類地位進行了研究[8]。很多學者研究了沼液對草莓土傳病害的防治效果，并從中分離了拮抗細菌[9]。還有學者對不同季節的沼液中細菌的形態與含量進行了研究[10]。筆者對從沼液中分離純化出的大腸桿菌K-12、大腸桿菌IAA和枯草芽孢桿菌 PS832進行理化性質和相關抗性研究，旨在為沼液的運用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試樣本 沼液樣本采集于婁底市新化、雙峰等地區的4個生豬規模養殖場，采集點為發酵罐出口和曝氣池出口處。

1.1.2 試劑和儀器設備 實驗室主要試劑為氯化鈉（NaCl）、氨芐霉素（AMP）、卡那霉素（Kana）、慶大霉素（Genta）、鏈霉素（Strept）、草酸銨（A.oxa）等，其他試劑：酵母浸出液體、無水乙醇、胰蛋白胨、瓊脂粉、蒸餾水、甘油、無菌水、結晶紫、碘液、95%乙醇、蕃紅染液。儀器設備：EP管、燒杯、錐形瓶、培養箱、冰箱等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣本前處理 采集的沼液樣本存放于2 mL EP管中，每個點取樣為3管，共6 mL，做好標記。

1.2.2 培養液和培養基的配置 培養液和培養基為LB，配方：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，蒸餾水1 L，瓊脂15～20 g /L （用于培養基）。配制流程如下：稱取胰蛋白胨4 g、酵母提取物2 g、氯化鈉4 g，放入500 mL燒杯中;加入400 mL蒸餾水用玻璃棒攪拌均勻直至溶解;分別倒入2個250 mL的錐形瓶中，每個錐形瓶200 mL溶液;分別稱取瓊脂粉2份，每份4 g，然后分別加入2個錐形瓶中，用棉塞將錐形瓶口塞嚴后用報紙包裹瓶口，并用細繩幫助固定報紙。

1.2.3 涂板培養 將豬場采集的沼液樣本進行涂板培養，分別取200 μL樣本涂布到配制好的LB培養板上，具體操作如下：（1）將涂布器放在火焰上灼燒滅菌，在火焰旁冷卻涂布器;（2）打開盛有原沼液的EP管，將試管口通過火焰;用200 μL移液器吸取200 μL標號為1-1的原沼液緩慢打入LB培養板中，將已冷卻的涂布器將原液涂布均勻，將試管口過火焰，并塞上棉塞，灼燒涂布器，待其冷卻;（3）重復以上操作，分別涂布好樣本;（4）將平板倒置，放入37℃培養箱中培育24～48 h后查看其菌落生長狀況并拍照記錄。

1.2.4 單菌落培養 用接種環挑取遠離群菌落的單菌落劃線培養。

1.2.5 革蘭氏染色 將分離純化出的無污染的單菌落挑出，進行革蘭氏染色。革蘭氏染色法[10]。

1.2.6 菌種保存 （1）將要保存菌種接種于LB液體培養至對數生長期（肉眼可見培養液渾濁即可）。（2）將300 μL甘油裝于1 mL離心管中并和槍頭等試驗用品用高壓滅菌鍋于121℃滅菌30 min。（3）無菌條件下將菌液700 μL混合于裝有甘油的離心管中，于-80℃冰箱內保存。

1.2.7 菌種鑒定 將甘油保存好的菌種的其中一份快遞寄到上海生工進行16sRNA測序。登陸NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/），將測序結果進行BLAST比對，選擇100%匹配的結果為菌種的種名。

1.2.8 抗性試驗 確定菌種后使用常見的抗生素（氨芐、卡納、慶大霉素、鏈霉素）對其進行處理，試驗前準備好1 000、200 、100 μL槍頭，用槍頭盒裝好以及用報紙包裹好后滅菌。培養基配置倒板前加入抗生素液體（氨芐、卡納、慶大霉素、鏈霉素），搖勻后倒板。做好抗生素板后，接種單菌落進行恒溫箱37℃過夜培養，觀察是否有菌落長出。

1.2.9 超聲波實驗 挑取單菌落進行小管擴大培養，5 h后觀察培養液是否變渾濁，然后進行OD600的濃度測量，稀釋10倍后，將裝有菌液的5 mL EP管放入細胞超聲波破碎機（置于冰上破碎）。同時，取原菌液200 μL進行涂板，標記為1號板。設置功率為200 W，間斷性地超聲（工作10 s，間歇10 s）。第一次超聲波次數為10次，然后吸取200 μL進行涂板，標記為2號板。輕輕搖勻后繼續超聲10次，吸取200 μL進行涂板，標記為3號板，依次進行上述超聲和涂板，超聲波次數分別為0、10、20、30次。涂板培養后觀察結果。

2 結果與分析

2.1 沼液涂板

4個豬場分別編號為1、2、3、4號豬場，在每個點取樣中各取200 μL沼液樣本涂板，菌落長勢情況如圖1、圖2。

2.2 菌落形態觀察

2.2.1 未知菌落1 挑取單菌落在37℃下培養18 h后形成的單菌落直徑約1.5 mm左右。菌落呈現灰白、半透明，小凸起，邊緣整齊光滑，在LB培養板上培養有特殊氣味產生。菌落形態見圖3A。

2.2.2 未知菌落2 挑取單菌落在37℃下培養18 h后形成的菌落，菌落形態為白色，圓形，表面光滑，半透明，邊緣潮濕。培養結果見圖3B。

2.2.3 未知菌落3 挑取單菌落在37℃下培養18 h形成菌落，菌落較大，表面呈白色，表面典型的粗糙不規則，有較多隆起和褶皺，膨大化，邊緣不透明。培養結果見圖3C。

2.3 革蘭氏染色

對未知菌落1的革蘭氏染色后，呈現出紅色，鑒定為革蘭氏陰性菌（見圖4A）;對未知菌落2的革蘭氏染色后，呈現出紅色，鑒定為革蘭氏陰性菌（見圖4B）;對未知菌落3的革蘭氏染色后，呈現出紫色，鑒定為革蘭氏陽性菌（見圖4C）。

2.4 測序鑒定

將菌液樣本送到上海生工測序，將序列通過BLAST比對，在基因庫中找出匹配率最高的物種，結果未知菌落1、2、3分別為大腸桿菌K-12、大腸桿菌IAI、枯草芽孢桿菌PS832。

2.5 抗性分析

2.5.1 大腸桿菌K-12 將大腸桿菌K-12分別接種于氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的抗生素板上，結果表明K-12對氨芐青霉素、卡那霉素有一定的抗性，對鏈霉素和慶大霉素較為敏感（見圖5）。

2.5.2 大腸桿菌IAI 將大腸桿菌IAI分別接種于氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的抗生素板上，結果表明IAI對氨芐青霉素和鏈霉素不敏感，但對慶大霉素和卡那霉素敏感（見圖6）。

2.5.3 枯草芽孢桿菌PS832 將枯草芽孢桿菌PS832分別接種于氨芐青霉素、卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素的抗生素板上，結果表明草芽孢桿菌 PS832對氨芐霉素，卡那霉素和慶大霉素敏感，對鏈霉素不敏感（見圖7）。

2.6 超聲波處理

超聲波處理結果（圖8-10）表明，以功率200 W超聲波破碎機超聲破碎10次能殺滅部分細菌，20次、30次超聲波處理可以達到理想滅菌效果。

3 結 論

3.1 大腸桿菌IAI

經過鑒定與分析，發現大腸桿菌IAI對慶大霉素和卡那霉素極為敏感，超聲波也能影響大腸桿菌IAI的生長，此次研究發現，在沼液中加入慶大霉素、鏈霉素兩種抗生素能夠抑制部分菌的生長，但是長期使用抗生素容易使菌變異產生抗藥性，而且經濟成本太高，若將發酵后的沼液經過功率為200 W，且大于30次超聲波處理，就能夠將其中的部分細菌殺死，就能將沼液循環利用。

3.2 大腸桿菌K-12

經過鑒定與分析，發現大腸桿菌K-12對氨芐青霉素和卡那霉素兩種抗生素具有一定的抗性，但慶大霉素、鏈霉素兩種抗生素能夠抑制大腸桿菌k-12生長，但是長期使用抗生素容易使菌變異產生抗藥性，若利用功率為200 W，且大于30次超聲波處理，就能夠將大部分細菌殺死，就能將沼液循環利用。

3.3 枯草芽孢桿菌PS832

經過鑒定與分析，發現枯草芽孢桿菌PS832對氨芐青霉素、慶大霉素和卡那霉素都極其敏感，所以對其的處理也是較為容易的。鏈霉素對大部分的革蘭氏陽性菌都存在抑制作用[9]，可是在本實驗中對枯草芽孢桿菌生長無影響?？莶菅挎邨U菌PS832對鏈霉素不敏感的原因可能是實驗豬場長期使用鏈霉素作為生豬的治療藥劑，導致其產生抗藥性，當然也可能是出現了噬菌體污染的情況，不過還需要進一步驗證[11]，當然超聲處理也能起到殺滅枯草芽孢桿菌PS832的作用。

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（責任編輯：張煥裕）