孕酮通過ABHD2 受體介導的cAMP-PKA 信號通路調控精子受精功能的研究*

江 峰 朱 勇 陳 穎 湯曉峰 楊岳洲 陳國武 劉玉林 孫曉溪**

1. 上海集愛遺傳與不育診療中心（上海200011）；2. 復旦大學附屬婦產科醫院

孕酮屬于類固醇類激素，是調節成熟精子功能最重要的生理激素之一，能瞬間增加精子胞內Ca2+離子和cAMP 含量，激活精子獲能、超活化、趨化性和頂體反應等生理功能，孕酮生理效應主要通過相關性膜受體介導的非基因組效應完成[1]。 此后，2016 年發現了a/b 水解酶2 (abhydrolase domain containing protein 2，ABHD2） 是孕酮對精子靶蛋白中作用的非基因組效應的核心功能蛋白[2]。 然而，ABHD2 在不育癥患者精子膜表面的表達情況暫無報道，我們擬通過比較臨床不育（選擇少弱精子癥和頂體反應異常患者）與正常生育男性之間ABHD2 的表達， 探究不同組間是否存在差異。 另外ABHD2 如何快速激活胞內相關信號分子的功能還不清楚， 擬通過體外對ABHD2 上下游信號通路研究， 探明孕酮是否通過ABHD2 調控cAMP-PKA（環磷酸腺苷- 蛋白激酶A）信號通路進而影響精子的功能活性，對闡明受精機制和男性不育癥診療等作用具有重要臨床意義。

材料和方法

一、材料和主要試劑

按WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版） 確診為男性少弱精子癥組（排除精子濃度≤5×106/ml）、精子頂體反應測定異常組（精子頂體功能檢測采用WHO 第五版推薦的PSA-FITC 染色法） 不育患者為研究對象（實驗組）和將符合人類精子庫捐精標準的正式捐精后生育者（對照組或正常生育組）；年齡均小于35 周歲， 簽署醫學倫理知情同意書（JIAIE2017-08）。

Percoll 精子分離液、Trizol (sigma,USA)、TaKaRa反轉錄試劑盒（RR047A）、一般PCR 試劑（TaKaRa）、P4（孕酮）/BCA 蛋白定量試劑盒、人cAMP ELISA 試劑盒（蘇州卡爾文生物科技有限公司）、細胞PKA 激酶活性定量檢測試劑盒（上海杰美基因醫藥科技有限公司/GMS50059.1）、ABHD2 一 抗（Abcam/ab230417）、精 子頂體染色試劑盒（安徽安科生物工程公司）等。

二、實驗分組及方法

（一）ABHD2 在男性不同組mRNA 表達變化

1. 分組：均禁欲2-7 天，采用手淫取精置于無菌取精杯。按照WHO 精液參數標準第5 版要求進行檢查前準備及精液分析評估進行分組。 正常組精子樣本、少弱精子組樣本（排除精子濃度≤5×106/ml）、頂體異常精子組樣本，每組30 例樣本。

2.RNA 提取及RT-PCR 分析：將Percoll 分離獲得的精子，精子RNA 提取采用Trizol(sigma,USA),4℃，12000 g 離 心5 min。 參 照 TaKaRa 反 轉 錄 試 劑 盒（RR047A）說明書，配置20μL RNA 和緩沖體系，42℃放置5min，37℃放置20min，80℃放置1min。 采用羅氏Roche480 熒光定量PCR 儀和軟件， 將β-actin 作為內參， 引物的序列如下：β-actin 上游引物(5'-3')ATCTC CTTCTGCATCCTGTCGG, 下游引物(5'-3')CATGGAG TCCTGGCATCCACGA；ABHD2 上游引物(5'-3')CCTC ATGTTTGCCTTCTTTGC,下游引物(5'-3')GGCGGGTA CATTTCTCCATC。 進行熒光定量PCR 和數據結果分析。

3. Western-blot（蛋白質印跡法WB）檢測ABHD2的蛋白表達水平： 利用Trizol 法提取精子的總蛋白，利用BCA 蛋白定量法進行定量，Western-blot 檢測ABHD2 表達情況。

（二）不同研究個體對孕酮的敏感性研究

1. 實驗分組：分為實驗組（少弱精子癥組）、實驗組+ 孕酮（P4）、對照組（捐精后生育組）、對照組+ 孕酮（P4），每組10 個樣本。 因后續實驗需觀察頂體反應等，故第一部分頂體反應異常者不再后續入組。

2.方法： 將Percoll 分離獲得的精子， 在37℃，5%CO2孵育箱中孵育3.5h 使精子獲能， 然后參考相關文獻[3,4]按上述分組加入3μM(μmol/L)孕酮（P4）繼續孵育2h 后進行后續實驗。

3.Western-blot（蛋白質印跡法）檢測ABHD2 的蛋白表達水平（4 組X1 個指標）：利用Trizol 法提取精子的總蛋白， 利用BCA 蛋白定量法進行定量，Western-blot 檢測ABHD2 表達情況。

（三）調控cAMP-PKA 信號通路影響精子功能活性研究

1. 實驗分組（4 組）：正常生育組（A）、正常生育組+P4（B）、正常生育組+P4+ABHD2 抗體(C)、正常生育組+P4+PKA 擬制劑H-89(D)。

2.方法： 將Percoll 分離獲得的精子， 在37℃，5%CO2孵育箱中孵育3.5h 使精子獲能，B 組加入3μM 孕酮（p4）,C 和D 組在P4 加入前分別用ABHD2 抗體和PKA 擬制劑H89 100 μM，預處理15min，加入P4,2h 后進行后續實驗。

3.ELISA 檢測cAMP、PKA 的水平： 處理結束后，收集精子細胞，加入細胞裂解液，用ELISA 檢測cAMP和PKA 的水平。

4.FITC-PSA 染色檢測各組精子的頂體反應：用精子頂體染色試劑盒， 精子處理后加入工作液， 固定封片，熒光顯微鏡下觀察精子涂片。

三、統計學方法

運用SPSS 20.0 軟件進行統計，組間比較采用單因素方差分析，差異顯著性為P＜0.01。

結 果

一、熒光定量PCR 結果

檢測正常生育組、少弱精子組、頂體異常組中ABHD2mRNA 水平表達變化。結果如圖1 所示，和正常生育組相比，少弱精子組和頂體異常組中ABHD2 mRNA水平顯著減少（F:90.84,P＜0.01）。

二、三組ABHD2 水平兩兩比較

頂體異常組與少弱精組差異具有統計學意義（F:7.46,P＜0.01）。 頂體異常組與正常組差異具有統計學意義（F:13.45,P＜0.01）。 少弱精子組與正常組差異具有統計學意義（F:5.99，P＜0.01）。 Western blot（蛋白質印跡法）檢測正常生育組、少弱精子組和頂體異常組中ABHD2 蛋白水平表達變化。結果如圖1 所示，顯示和正常生育組相比，少弱精子組和頂體異常組中ABHD2 蛋白水平顯著減少。

圖1 熒光定量PCR、WB 分析各組ABHD2 蛋白表達變化

三、觀察不同個體精子對孕酮（P4）的敏感性差異

Western blot 檢測對照組、對照組+P4、實驗組和實驗組+P4 中ABHD2 蛋白水平表達變化。結果如圖2所示，結果顯示，和對照組相比，實驗組中ABHD2 蛋白水平表達明顯減少； 在對照組中加入孕酮處理后，ABHD2 蛋白水平表達明顯增加。 而實驗組中加入孕酮處理后， 與未加孕酮相比，ABHD2 蛋白水平表達增加不明顯。

圖2 WB 分析各組中ABHD2 蛋白表達變化

四、ELISA 檢測正常生育組、正常生育組+P4、正常生育組+P4+ABHD2 抗體、正常生育組+P4+PKA 擬制劑H-89 中PKA 活性變化

結果如圖3 所示，和正常生育組相比，在正常組中加入P4 處理后，PKA 活性極顯著增加（P＜0.01），繼續加入ABHD2 抗體或PKA 擬制劑H89 后PKA 活性均顯著減少（P＜0.01）。

圖3 ELISA 分析各組中PKA 活性變化

五、ELISA 檢測正常生育組、 正常生育組+P4、正常生育組+P4+ABHD2 抗體、正常生育組+P4+PKA 擬制劑H-89 中cAMP 濃度變化

結果如圖4 所示，和正常生育組相比，在正常組中加入P4 處理后，cAMP 濃度極顯著增加（P＜0.01），繼續加入ABHD2 抗體或PKA 擬制劑H89 后cAMP 濃度均顯著減少（P＜0.01）。

圖4 ELISA 分析各組中cAMP 濃度變化

六、FITC-PSA 染色檢測各組精子的頂體反應

結果如圖5 所示， 結果顯示在正常生育組和正常生育組+P4 中，頂體完整，精子頭部熒光染色明亮且均勻， 特別是在正常生育組+P4 中， 赤道帶也出現熒光帶。 正常生育組+P4+ABHD2 抗體、 正常生育組+P4+PKA 擬制劑H-89 中精子頭部熒光染色稍微減弱，赤道帶未出現熒光帶。

圖5 FITC-PSA 染色檢測各組精子的頂體反應變化

討 論

孕酮（P4）通過激活人類和小鼠精子表面的鈣離子通道（CatSper）來調控精卵結合功能。已有研究表明，精子獲能、頂體反應及精子趨化作用都依靠鈣離子內流，鈣離子通道發生障礙或缺失會導致不育[5]。 孕酮作為胞外信號，能夠通過ABHD2[2]，激活人類精子的CatSper，從而強力激發精子鞭毛上的主要Ca2+離子通道， 直接誘導鈣離子內流[6]，無須激活核內受體，發揮非基因組性質的激活效應。 ABHD2 的作用具體機制首先與孕酮結合， 激活ABHD2 從而分解三酰甘油脂肪， 產生2AG， 使 得CatSper 的 抑 制 劑1AG/2AG 轉 化，使CatSper 處于活化狀態，Ca2+離子內流，激活下游信號而起作用[7]。 然而，ABHD2 在臨床不育患者中的表達模式差異， 以及如何快速激活胞內相關信號分子的功能研究還少有報道。

本研究首先通過比較正常生育組與少弱精子癥組、頂體反應異常組精子之間在ABHD2 mRNA 和蛋白水平表達變化，發現組間的明顯差異，且同樣為不育病人， 頂體反應異常組表達水平發生變化更明顯高于少弱精子癥組（圖1），在輔助生殖臨床上也反映出受精率低等表現。 另外初步比較對照組（正常生育組）與實驗組（少弱精子組）之間ABHD2 在蛋白水平表達上存在明顯差異，同時添加孕酮（P4）處理后，在對照組中ABHD2 蛋白水平表達明顯增加。 而實驗組與未加孕酮時相比，ABHD2 蛋白水平表達增加不明顯。 說明不同個體存在表達差異、調控差異，以及對孕激素的敏感性存在差異， 這種差異或能成為評估精子活性和輔助生殖中精卵結合的趨化作用等的新功能指標。

環磷酸腺苷- 蛋白激酶A（cAMP-PKA）是被發現參與類固醇類激素調控的非基因組效應的細胞第二信使，其調控主要是通過激活腺苷酸環化酶，增加細胞內cAMP 含量，從而活化cAMP 依賴的PKA，導致精子中相關蛋白絲氨酸、蘇氨酸磷酸化以及酪氨酸磷酸化，進而調節精子獲能、超活化、趨化性和頂體反應等多種生理過程[8]。 本研究通過正常生育組添加P4 處理后，PKA活性和cAMP 濃度極顯著增加，繼續加入ABHD2 抗體或PKA 擬制劑H89 后，PKA 活性和cAMP 濃度則均顯著減少。并且通過FITC-PSA 染色檢測不同組精子的頂體反應，正常生育組和+P4 組頂體完整，精子頭部熒光染色明亮且均勻， 特別是在正常生育組+P4 中赤道帶也出現熒光帶，ABHD2 抗體組和PKA 擬制劑H89組精子頭部熒光染色稍微減弱，赤道帶未出現熒光帶，證實了孕酮與ABHD2 蛋白結合對調控cAMP-PKA 信號通路的影響， 以及激活精子Ca2+離子依賴性頂體反應等生理功能。

早期已有發現表明， 孕酮可以通過競爭性擬制物（如睪酮、氫化可的松）來調控CatSper 通道[9]。 而ABHD2 的發現，不僅可以幫我們解釋某些不明原因不育，如果找到阻斷ABHD2 的方法，我們就會發現另一種避孕的方法[10]。 本研究初步探明精子胞內cAMP-PKA 通路可干擾孕酮激素與ABHD2 蛋白結合， 封鎖CatSper通道， 可以阻止精子的活躍運動， 使其重回非激活狀態。 但這種機制并不會影響自然狀態下精子本身細胞存活，即精子細胞無毒副作用，精子依然可以游動，只是沒有足夠的動力促使它們進入卵細胞而已[11-12]。 對ABHD2 上下游信號通路的研究對闡明受精作用、男性不育機制、研發新型非激素類避孕藥，以及研究類固醇激素的臨床作用機制也提供了非常重要的基礎。