基于1 046例肺癌靶向基因檢測的ARMS-PCR和NGS技術優勢分析

朱麗蒙，馬楠，任曉妮，張暋

(鄭州金域臨床檢驗中心有限公司 實驗診斷部，河南 鄭州 450000)

突變擴增阻滯系統-鏈式聚合酶反應(amplification refractory mutation system-PCR，ARMS-PCR)技術和下一代測序(next generation sequencing，NGS)技術是目前臨床上常用的兩種靶向基因突變檢測方法。ARMS-PCR具有高靈敏度和高特異性，突變檢出率遠超傳統的PCR，已成為腫瘤個體化分子檢測最普遍、最重要的技術之一[1]。另一方面，NGS以邊合成邊測序為原理，具有通量高、檢測類型多樣的優勢，越來越多地應用于臨床肺癌靶向基因檢測[2]。NCCN建議，臨床非小細胞肺癌靶向治療前采用ARMS-PCR或NGS技術進行基因突變檢測，包括EGFR、KRAS、BRAF、MET、RET基因突變和ALK、ROS1和NTRK基因重排等。不同場景下，如何選擇合適的檢測技術是臨床常面臨的問題[3]。本研究基于1 046例肺癌靶向基因檢測樣本的結果統計，對比闡述ARMS-PCR和NGS技術的優勢，幫助臨床醫生在肺癌靶向治療中有效選擇相應的檢測方法，避免時間和資源的浪費。

1 材料和方法

1.1 材料選取2018年1月至2020年3月從河南省內各地區的醫療機構送至鄭州金域臨床檢驗中心有限公司檢測肺癌靶向基因的病例。排除資料不清或診斷不明的，篩選出1 046例樣本，臨床診斷結果均為疑似或確診肺癌，年齡30～90歲，年齡中位數67歲，男554例，女492例。樣本類型包括活檢組織的石蠟包埋組織(formalin fixed paraffin-embedded，FFPE)、新鮮血漿。將FFPE樣本772例按檢測方法分為兩組：NGS方法329例，ARMS-PCR方法443例；將游離血漿樣本274例按檢測方法分為兩組：NGS方法83例，ARMS-PCR方法191例。

1.2 實驗方法ARMS-PCR技術平臺采用ABI 7500 熒光定量擴增儀，組織樣本核酸提取試劑盒為QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (貨號：56404)，游離血漿核酸提取試劑盒為QIAamp ccfDNA/RNA Kit(貨號：55184)，PCR檢測試劑盒涵蓋G719S、G719C、G719A、S768I、T790M、L858R、L861Q等7個突變位點和29個19號外顯子缺失突變。數據質控指標為：組織樣本內參Ct值為14～19，游離血漿內參Ct值<28。

NGS技術以邊合成邊測序為原理，通過對PCR分子簇上堿基連接的熒光信號進行捕獲，并轉換為堿基信息。靶向區域測序是指針對目的基因的特定區域進行NGS測序，通過探針雜交捕獲或PCR擴增，將基因的靶向區域構建成特定大小范圍的DNA或cDNA片段文庫，再對其進行測序分析[4]。NGS技術平臺采用Illumina NextSeq 550儀器，KAPA構庫試劑，IDT定制靶向基因探針，Illumina上機試劑(貨號：FC-404-2004)；定制探針覆蓋22個靶向基因的全外顯子，可檢測的突變類型有點突變和小片段插入/缺失、剪切子變異、拷貝數變異和4個基因的重排，22個基因包括AKT1、ALK、BRAF、CTNNB1、DDR2、EGFR、ERBB4、FBXW7、FGFR1、FGFR2、FGFR3、HER2、KRAS、MAP2K1、MET、NOTCH1、NRAS、PIK3CA、PTEN、SMAD4、STK11、TP53；基因重排包括ALK重排、RET重排、ROS1重排、NTRK1重排。數據經生信分析成突變注釋表，質控指標：Q30>0.85，捕獲特異性>65%，靶向區域覆蓋度>99%，去重后深度大于500X的靶向區域>90%。基因突變報告參考ACMG解讀標準[2]以及ACMG的意外發現變異的指南[3]，Ⅰ類變異為有致病意義、Ⅱ類變異為潛在致病意義、Ⅲ類變異為致病意義未明，均應報告為檢出突變[5-6]。

1.3 統計學分析采用SPSS 21.0統計軟件進行分析。計數資料以頻數和率(%)表示，采用χ2檢驗、連續校正χ2檢驗比較NGS技術和ARMS-PCR技術檢測EGFR基因主要突變位點的檢出率和總檢出率，分析NGS方法和ARMS-PCR方法檢測非小細胞肺癌靶向基因的變異類型的特點。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 FFPE樣本EGFR基因已知位點突變檢出率NGS技術與ARMS-PCR技術對FFPE樣本EGFR基因已知位點突變總檢出率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。ARMS-PCR技術對FFPE樣本外顯子18(G719X)、外顯子20(T790M)、外顯子19(缺失突變)、外顯子21(L861Q)、外顯子20(S768I)突變的檢出率分別與NGS技術比較，差異無統計學意義(P>0.05)。ARMS-PCR技術對外顯子21(L858R)突變的檢出率高于NGS技術(P<0.05)。見表1。

表1 NGS技術和ARMS-PCR技術對FFPE樣本EGFR基因已知位點檢出率比較[n(%)]

2.2 血漿樣本EGFR基因主要位點突變檢出率NGS技術與ARMS-PCR技術對血漿樣本EGFR基因主要位點突變總檢出率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。ARMS-PCR技術對血漿樣本外顯子20(T790M)、外顯子19(缺失突變)、外顯子21(L858R)突變的檢出率分別與NGS技術比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 NGS技術和ARMS-PCR技術對血漿樣本EGFR基因主要位點檢出率比較[n(%)]

2.3 NGS技術檢測肺癌EGFR基因未知/罕見突變NGS方法檢出EGFR基因擴增16例，檢出率4.89%(16/329)，另外檢出1例與L858R突變同時發生的C797S/T790M順式變異，提示患者對三代EGFR-TKI耐藥。見表3。

表3 NGS技術對FFPE樣本EGFR基因未知/罕見突變的檢出情況(n)

2.4 NGS技術檢測肺腺癌和肺鱗癌多基因突變譜NGS檢測肺癌靶向基因套餐的FFPE樣本中，214例確診為肺腺癌，34例確診為肺鱗癌。與肺腺癌比較，NGS技術對FFPE樣本肺鱗癌TP53和PIK3CA基因突變檢出率較高，對EGFR基因突變檢出率較低(P<0.05)。NGS技術對FFPE樣本肺鱗癌PTEN、KRAS、CTNNB1、MET、SMAD4、BRAF基因突變檢出率分別與肺腺癌中比較，差異無統計學意義(P>0.05)。ERBB2、ALK融合、RET融合、ROS1融合4個基因肺鱗癌例數為0，暫不做數據統計。見表4。

表4 NGS技術對FFPE樣本肺腺癌和肺鱗癌多基因突變檢出率比較[n(%)]

3 討論

ARMS-PCR與NGS技術都是由普通PCR發展和衍生出來用于檢測基因信息的技術，ARMS-PCR技術的優勢在于高特異性和靈敏度，理想狀態下，靈敏度可達0.5%[1]。因此，可以解釋ARMS-PCR方法檢測FFPE樣本的L858R突變有更高的檢出率。從原理上來說，NGS技術在生物信息分析的過程中可能有一定的錯誤率[7]，但是，通過提高二代測序的測序深度可降低錯誤率，提高靈敏度，從而可達到與ARMS-PCR一致的整體檢出率。檢測血漿、胸腔積液、腦脊液等體液中的游離循環DNA(free circulating DNA，cfDNA)，被稱作液體活檢。釋放在體液中的腫瘤細胞被稱為循環腫瘤細胞(circulating tumor DNA，ctDNA)，血漿內質量濃度只有5～10 μg·L-1，要求檢測技術有較高的靈敏度和特異性。NGS技術檢測血漿樣本核酸時，會在上機前設計較高的數據量(一般為蠟塊樣本的10倍以上數據量)，以便達到足夠高的測序深度，從而提高檢測的靈敏度。由此可知，在石蠟包埋樣本和血漿樣本中，ARMS-PCR的檢出率與引物設計和擴增條件有關，而NGS技術的檢出率會受測序深度影響，在兩者條件優化的情況下，可能使總檢出率達到一致。本研究結果顯示，NGS技術與ARMS-PCR技術對EGFR基因總檢出率無明顯差異。受檢測條件的影響，某些位點的檢出率可能有所變化，如本研究中ARMS-PCR技術對EGFR基因L858R突變的檢出率高于NGS技術。

本研究結果中，ARMS-PCR檢測到EGFR基因點突變和基因小片段缺失；NGS方法檢測到更多EGFR基因的突變類型，包括基因小片段插入、拷貝數變異、基因融合等。根據NGS測序結果，可判斷出雙突變是順式(位于同一等位基因上)，還是反式(位于不同等位基因上)。對于C797S/T790M雙突變，順式和反式有截然相反的臨床意義，即順式對EGFR-TKI靶向治療耐藥，而反式對EGFR-TKI靶向治療敏感[8]。從原理上來說，ARMS-PCR技術也可以用于定量檢測RNA水平的拷貝數變異，預測蛋白表達水平是否增高，或用于檢測RNA水平的基因重排。然而，由于肺癌蠟塊組織樣本提取RNA碎片化較嚴重，檢測有一定難度，目前尚無成熟試劑盒應用于臨床。NCCN指南更推薦熒光原位雜交技術(FISH)用于ALK和ROS1基因重排的檢測[3]。采用NGS技術檢測基因重排，可通過基因比對，推測基因斷裂和重排位點，預估重排的突變頻率，用于臨床時，常與FISH結果相互驗證。NGS技術也可以檢測到DNA片段的拷貝數，其用生物信息分析的方法，計算出拷貝數增多或減少，預測蛋白是否過表達，臨床上常用FISH技術或免疫組化進行驗證[9]。在肺癌靶向治療檢測中，NGS比ARMS-PCR技術的通量高，檢測范圍廣，當臨床活檢樣本較少時，可以一次性獲得更多基因突變信息，為臨床提供更全面的治療依據。

臨床可根據基因突變譜對癌種進行輔助診斷和分型。EGFR基因突變、ALK融合和ROS1融合可指導臨床選用相應的靶向藥。在本研究中，NGS技術檢測肺腺癌和肺鱗癌表現出不同的基因突變譜。肺鱗癌對EGFR-TKI靶向治療的效果不佳[10]，故臨床上肺癌靶向基因檢測多用于肺腺癌患者的用藥指導。本研究結果顯示，肺腺癌中EGFR基因突變檢出率高于肺鱗癌。NGS肺癌檢測套餐還可同時檢測KRAS、PTEN、PIK3CA、ERBB2等基因突變，在治療前、治療中、治療后監測是否有原發或繼發的耐藥突變，指導臨床優化用藥方案。本研究中，TP53基因是突變檢出率最高的基因。TP53是典型的抑癌基因，TP53基因失活突變是肺癌預后不良的標志[11]。NGS因高通量的特點常被作為大規模人群基因組檢測項目的技術手段，以幫助研究人員了解種群之間的突變譜差異，檢出未知突變，便于發現新發突變與不同疾病和治療之間的關系，用于疾病的診斷和新靶向藥物的開發。但是，ARMS-PCR技術無法檢測基因突變譜。

NGS檢測時間和經濟成本比較高。一般的肺癌靶向基因NGS檢測流程包括核酸提取、構建DNA文庫、靶向捕獲、上機檢測、生物信息學分析、突變意義分析和報告等步驟，需耗時3～5 d。再加上價格高昂的儀器和上機試劑，對于基層醫院來說，設備及項目的推廣存在困難。而ARMS-PCR雖然只常用于檢測已知位點，但其實驗流程只需要核酸提取、試劑配制、上機檢測、結果報告，全程可在幾個小時內完成。儀器和試劑價格也易于接受，利于臨床項目的開展。

綜上，若臨床所需檢測的突變都在已知范圍內，可選擇ARMS-PCR技術對其進行位點檢測。ARMS-PCR技術特異性高，靈敏度高，適用于已知突變靶向用藥效果檢測和痕量殘留突變的檢測，由于其設備及試劑成本低，實驗流程時間短，操作方便，易于在基層醫院推廣；NGS靶向測序技術操作復雜，時間長，成本較高，但是其檢測通量高，范圍廣，適合于用藥方案制定初期的靶向基因篩查，制定用藥方案；病程變化時，可使用NGS技術篩查是否有新發的耐藥基因突變，優化用藥方案，以及評估預后等。同時，NGS作為一種臨床研究的手段，可以用于繪制種群突變譜，發現新發突變，總結突變與疾病發生、進展、轉移之間的關系，為開發新的快速診斷方法、新的靶向藥物提供依據。對于ARMS-PCR和NGS兩種檢測技術，臨床可根據檢測目的和病程，采用適合的檢測項目或套餐。